《Toxicon》：Purification and Characterization of Two Neurotoxins BmKNT1 and BmKNT2 from the Scorpion
Buthus martensii Karsch venom
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本研究从沙漠蝎毒中分离纯化出两种神经毒素BmKNT1和BmKNT2，经质谱鉴定其氨基酸序列分别为69和64个残基。电生理分析表明BmKNT2抑制钾通道，BmKNT1激活钾通道，两者均抑制钙通道活性。
尤素夫·阿里|沙姆西丁·法兹利丁诺夫|艾琳·胡|纳齐尔穆·东穆拉蒂|韩贺|子阳|杨彦华|阿赫米丁·瓦利|哈吉·阿克贝尔·艾萨|沙拉菲特丁·米尔扎阿赫梅多夫|阿克马尔·阿斯罗罗夫|阿布利米蒂·伊利
中国科学院新疆物理化学技术研究所新疆本土药用植物资源利用国家重点实验室及干旱地区植物资源化学重点实验室，中国乌鲁木齐市北京南路40-1号
摘要
蝎子毒液是一种由蛋白质和肽组成的混合物，其中许多成分具有多种生物活性，包括抗肿瘤作用、调节离子通道、镇痛和抗炎效果。本研究通过凝胶过滤色谱（GFC）、离子交换色谱（IEC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）从Buthus martensii Karsch（BmK）的毒液中分离并纯化了两种肽：BmKNT1和BmKNT2。通过Edman降解和MALDI-TOF-MS/MS测序分析确定了BmKNT1（69个氨基酸残基，理论pI/Mw：7.66/7660.5 Da）和BmKNT2（64个氨基酸残基，理论pI/Mw：6.05/7270.33）的一级结构。这两种肽与其他蝎子神经毒素具有高度相似性。在100 μg/ml的浓度下，研究了这两种神经毒素对大鼠背根神经节（DRG）中Na+通道、K+通道和Ca2+通道的影响。结果表明，BmKNT2对DRG细胞上的K+通道具有抑制作用，这是电压门控钾通道孔隙抑制剂的典型特征；而BmKNT1则对DRG中的K+通道具有激活作用，同时两种毒素都对DRG中的Ca2+通道具有抑制作用。
引言
蝎子属于螯肢动物门蛛形纲。全球共有超过1500种蝎子，其中约30种对人类具有潜在危害（Garcia等人，1998年）。每年约有3000例蝎子蜇伤导致人类死亡（Ward等人，2018年；Ahmadi等人，2020年）。尽管蝎子主要因其毒液而闻名，但在亚洲和非洲的多个地区，包括埃及、中国和印度，数千年来人们一直将蝎子用于传统医学，以治疗风湿病、疼痛和炎症（Rap?so，2017年）。
蝎子毒液是蝎子生物活性成分的主要来源，是一种复杂的生化混合物，含有多种药理活性物质。其主要成分包括神经毒素肽、酶蛋白、无机盐、氨基酸衍生物和低分子量生物活性化合物。其中，神经毒素（主要是小分子肽）是其药理作用的关键成分，这些毒素具有显著的靶标特异性。它们通过精确的构象相互作用调节离子流动和细胞内信号通路，从而引发广泛的药理效应（Cid-Uribe等人，2020年）。蝎子神经毒素具有很强的镇痛效果。大多数从蝎子毒液中提取的肽通过调节电压门控钠（Nav）通道（尤其是Nav1.1、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9）来发挥镇痛作用（Xia等人，2023年）。在抗肿瘤方面，某些蝎子毒素肽通过靶向肿瘤相关氯通道并诱导线粒体功能障碍有效抑制肿瘤增殖和迁移（Baradaran等人，2019年；Deng等人，2023年）。部分蝎子神经毒素多肽通过调节NF-kB和MAPK等炎症通路发挥抗炎作用，从而调节细胞因子释放，有助于治疗自身免疫性疾病（Xia等人，2024年）。这些天然优化的毒素能够精确靶向生理通路，推动药理学治疗（如离子通道调节剂）、皮肤病制剂、诊断生物标志物和靶标验证探针的发展（Lafnoune等人，2025年）。
根据长度，蝎子毒液肽可分为长链肽和短链肽（Bermúdez-Guzmán等人，2022年）。其中，短链肽主要作用于电压门控钾通道，其氨基酸数量在30-40个之间（Kuzmenkov等人，2023年）；长链肽的氨基酸数量在60-70个之间，主要作用于电压门控钠通道（Housley等人，2017年）。这种分类具有一定的启发性。然而，对LmKTT-1a（Chen等人，2013年）和BmP09（Yao等人，2005年）的研究表明存在显著例外，这些例外挑战了这种简化的观点，揭示了更强的进化和功能多样性。LmKTT-1a（59个残基）虽然被归类为“长链”毒素，但它是一种钾通道毒素，作用于Kv1.3（IC50 ～1.58 μM），同时还具有胰蛋白酶抑制活性（Ki ～0.14 μM）。这种双重活性源于引入了Kunitz型结构折叠。此外，BmP09（66个残基）是一种长链肽，能强效且可逆地阻断BK通道（EC50 = 27nM），而不影响Na+通道。这种效应是由于C末端甲硫氨酸（Met66）的氧化修饰（烷基化）导致的，使毒素的靶标从Na+通道转向BK通道。这些发现不仅加深了我们对毒液肽进化的理解，也为设计具有更高特异性、可逆性和多靶点疗效的下一代肽类疗法提供了坚实的基础。
Buthus martensii Karsch（BmK）是中国常见的蝎子物种（分布于大多数省份），也在蒙古、韩国和朝鲜发现，其毒液毒性相对较低。该物种在中国传统医学中已有数百年的应用历史（Goudet等人，2002年）。李时珍在1578年编纂的《本草纲目》记载了使用整只蝎子治疗多种神经系统疾病，如中风、癫痫、面瘫和偏瘫。蝎子还因其镇静作用而被用于缓解脑膜炎、脑瘫和风湿病等疾病的疼痛（Wali等人，2019年）。传统蝎子制剂通常是外用或口服的，使用整只蝎子或粗提物。这些方法往往基于经验观察而非机制理解，缺乏标准化和安全控制。因此，现代的分离、纯化和鉴定技术对于分离和表征活性成分、阐明其作用机制以及降低毒性至关重要（Lafnoune等人，2025年）。迄今为止，先进的分离、纯化和结构鉴定技术已从BmK毒液中分离出多种活性成分，包括针对钠通道的α-蝎子毒素（如BmK-M1、BmK-M2、BmK-M4、BmK-M6、BmK-M7、BmK-M8、BmK-M9和BmK-16）、针对钾通道的β-蝎子毒素BmK IT-AP以及抗炎成分BmKKx2（Guan等人，2000年；Shen等人，2019年）。
在本研究中，从Buthus martensii Karsch（BmK）的毒液中分离并表征了一些具有蝎子毒液活性的肽，但我们对蝎子毒素生物活性的物质基础仍知之甚少。本研究描述了从Buthus martensii Karsch中提取的两种神经毒素（BmKNT1和BmKNT2）的纯化过程、氨基酸序列测定和电生理分析。
材料
TSK HW-55F（TOYOPEARL，日本）；蛋白质标记混合物购自北京Biotop Biotechnology有限公司；CM-650吸附剂购自北京Solarbio科技有限公司；10%十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙烯二胺（TEMED）、30%丙烯酰胺（Acr/Bis=29/1）、1 M Tris-HCl（pH=6.8）、1.5 M Tris-HCl（pH=8.6）和蛋白质样品缓冲液（5x）购自Biosharp Beijing Lanjeco Technology有限公司；使用的乙腈和三氟乙酸（TFA）
两种神经毒素的纯化
从Buthus martensi Karsch的粗毒液中分离离子通道活性肽的过程基于生物活性测定。如图1所示，通过初始的HW-55F凝胶过滤色谱得到了四个主要组分（S1-S4）。生物活性测定和SDS-PAGE分析表明组分S4具有目标生物活性。随后对该活性组分进行阳离子交换色谱（CM-650柱，pH 4.7）处理，得到了六个亚组分（S4-1至S4-6）
讨论
本研究报道了从Buthus martensi Karsch毒液中分离、表征和初步功能分析的两种新型长链肽BmKNT1和BmKNT2。它们的发现进一步丰富了人们对蝎子毒液毒素结构和功能的认识，尤其挑战了传统的长度靶标范式。
我们的结果表明，尽管BmKNT1和BmKNT2被归类为“长链”肽（分别为69个和64个氨基酸残基），但它们并不
结论
从中国Buthus martensii Karsch蝎子毒液中分别纯化和表征了两种肽：BmKNT1和BmKNT2。通过Edman降解和MALDI-TOF-MS/MS测序分析确定了BmKNT1（7660.5 Da）和BmKNT2（7269.5 Da）的一级结构，这两种肽与其他蝎子神经毒素具有高度相似性。在100 μg/ml的浓度下，研究了这两种神经毒素对大鼠背根神经节（DRG）中K+通道和Ca2+通道的影响。
作者贡献声明
沙拉菲特丁·米尔扎阿赫梅多夫：撰写原始稿件、方法学设计、数据管理。哈吉·阿克贝尔·艾萨：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调。阿布利米蒂·伊利：撰写、审稿与编辑、项目管理、研究实施、概念构思。尤素夫·阿里：撰写原始稿件、数据管理、概念构思。阿克马尔·阿斯罗罗夫：撰写、数据管理。艾琳·胡：软件操作、数据管理。沙姆西丁·法兹利丁诺夫：
利益声明
作者声明在本研究中不存在任何可能影响论文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：22578472）、国家自然科学基金青年科学基金（项目编号：82104017）、天池英才计划（项目编号：2024000051）以及新疆维吾尔自治区天山英才科技创新计划（项目编号：2022TSYCLJ0008）的支持。
