《Ultrasonics Sonochemistry》：Unveiling the potential of beetroot leaf as a sustainable source of proteins: insights into ultrasound-assisted extraction, functional properties and in vitro digestibility
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本研究针对甜菜根叶这一农业副产物中蛋白质资源浪费问题，系统优化了超声辅助碱法提取（UAAE）工艺。通过响应面法（RSM）优化，在pH 11、27.2°C、超声40 min的最佳条件下，蛋白提取率（9.0%）和蛋白含量（70.81%）均显著高于传统碱法提取（CAE）。研究表明，UAAE技术能有效改善甜菜根叶蛋白（BLP）的结构有序性、功能特性（如起泡性、乳化稳定性）及体外消化率（IVPD≈67%），为开发可持续的植物基蛋白原料提供了新策略。
在全球人口持续增长和可持续饮食需求日益迫切的背景下，寻找新型、可持续的蛋白质来源已成为食品科学领域的重大挑战。甜菜根在加工过程中，其叶片通常作为农业废弃物被丢弃，然而这些叶片却含有高达25-35%（干重）的粗蛋白，是一种潜力巨大但尚未被充分利用的植物蛋白资源。传统的碱法提取（Conventional Alkaline Extraction, CAE）虽然简单易行，但存在提取效率低、耗时耗能、且可能损害蛋白质功能特性等局限。因此，开发高效、环保的提取技术对于实现甜菜根叶蛋白（Beetroot Leaf Protein, BLP）的价值化、推动循环生物经济发展至关重要。
为此，一项发表在《Ultrasonics Sonochemistry》上的研究深入探讨了利用超声辅助碱法提取（Ultrasound-Assisted Alkaline Extraction, UAAE）技术从甜菜根叶中提取蛋白质的潜力。该研究旨在通过优化提取工艺，不仅提高蛋白得率和纯度，更全面表征所提蛋白的结构、功能特性和消化率，并将其与传统CAE方法进行系统对比，以评估UAAE技术的优势。
研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术方法。首先，他们以本地市场采购的新鲜甜菜根叶片为原料，经过清洗、干燥、粉碎制成均匀粉末。核心提取技术是采用了基于Box-Behnken设计（Box-Behnken Design, BBD）的响应面法（Response Surface Methodology, RSM）来优化UAAE的三个关键参数：超声时间、pH值和温度。随后，对通过CAE和优化后UAAE获得的BLP进行了系统的表征分析，这包括使用傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）分析蛋白质二级结构，X射线衍射（X-ray Diffraction, XRD）评估晶体结构，扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）和原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）观察微观形貌。此外，还测定了蛋白质的热稳定性（热重分析TGA和差示扫描量热法DSC）、界面性质（Zeta电位、界面张力）、功能性质（乳化稳定性-乳化指数、起泡性及稳定性）以及体外蛋白质消化率（In Vitro Protein Digestibility, IVPD）。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）用于分析蛋白质组成，氨基酸分析仪则用于测定氨基酸谱。
3.1. 不同因素对响应值的影响
通过RSM优化发现，对于提取率，超声时间和温度是显著影响因素，而pH值影响不显著；对于蛋白含量，超声时间、pH和温度均为显著因素。模型拟合优度高（R2 提取率=0.9157，蛋白含量=0.9808），预测准确。三维响应面分析表明，较高的pH和较长的超声时间有利于提高蛋白含量和提取率，而过高的温度则可能因蛋白质聚集变性而导致提取率下降。
3.2. 优化后的UAAE与CAE的比较
在最优条件（pH 11, 40 min, 27.2 °C）下，UAAE的提取率（9.0%）和蛋白含量（70.81%）均显著高于CAE（分别为5.5%和57.42%）。这表明超声波产生的空化效应能更有效地破坏植物细胞壁，增强传质效率，从而提升提取效率。
3.3. 结构表征
3.3.1. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
FTIR光谱显示，UAAE和CAE提取的BLP在酰胺带位置仅有轻微偏移，表明超声波处理未破坏蛋白质的主链结构。对酰胺I带去卷积分析发现，UAAE-BLP的α-螺旋和β-转角比例略有增加，β-折叠比例降低，这种二级结构的细微变化可能有利于其功能特性的改善。
3.3.2. X射线衍射（XRD）分析
XRD图谱显示，UAAE-BLP的衍射峰更尖锐、强度更高，相对结晶度（50.46%）显著高于CAE-BLP（28.09%），说明超声波处理使蛋白质分子排列更加有序，形成了更紧密的晶体结构。
3.3.3. 扫描电子显微镜（SEM）分析
SEM图像显示，UAAE-BLP呈现相对光滑、片层状重叠的形态，而CAE-BLP则表现为粗糙、棱角分明的团簇状聚集体。这表明超声波处理有助于形成更均匀、致密的蛋白质微观结构。
3.3.4. 原子力显微镜（AFM）分析
AFM三维形貌图进一步证实，UAAE-BLP的球状结构之间连接更紧密，形成更具连续性的网络结构；而CAE-BLP的球状结构则更为孤立和纤维状。这种纳米尺度的结构差异可能与UAAE-BLP更好的功能性质相关。
3.4. 热特性
3.4.1. 热重分析（TGA）
TGA曲线显示，UAAE-BLP在主要热分解阶段的质量损失峰值略高于CAE-BLP，且其DTG曲线出现肩峰，表明UAAE可能形成了更紧凑或更有序的分子网络，从而略微延迟了热分解过程。
3.4.2. 差示扫描量热法（DSC）
DSC曲线显示两种BLP均有四个吸热峰。UAAE-BLP的主转变峰（第三个峰）相对于CAE-BLP出现轻微肩峰，暗示超声波处理可能改变了蛋白质的变性/分解路径，形成了热稳定性略有不同的结构。
3.5. 功能特性
3.5.1. 乳化指数
乳液稳定性实验表明，BLP浓度是影响乳化指数（相分离程度）的主要因素，储存温度影响不大。在相同浓度下，UAAE-BLP制备的乳液稳定性通常优于或相当于CAE-BLP。此外，UAAE-BLP乳液颜色更浅（浅灰色/浅黄褐色），而CAE-BLP乳液颜色较深（深褐色/灰色），且两者在储存期间均呈现凝胶状质地。
3.5.2. 起泡特性
起泡能力（FC）随蛋白质浓度增加而增强，UAAE与CAE-BLP在相同浓度下无显著差异。起泡稳定性（FS）在1小时内均保持较高水平，且两种方法提取的蛋白之间也无显著差异。这表明BLP具有良好的起泡性能，超声波处理未对其产生负面影响。
3.6. 物理性质
3.6.1. 颗粒尺寸和Zeta电位
动态光散射结果显示，两种BLP的流体动力学粒径无显著差异。然而，UAAE-BLP的Zeta电位（-32.73 mV）绝对值显著高于CAE-BLP（-24.03 mV），表明UAAE-BLP颗粒表面带有更强的负电荷，这有助于通过静电斥力提高分散体系的稳定性。
3.6.2. 界面张力
在油-水界面张力测定中，CAE-BLP表现出更低的界面张力（22.23 mN/m），而UAAE-BLP的界面张力较高（26.30 mN/m）。较低的界面张力有利于乳液液滴的初始形成，而较高的Zeta电位则有助于乳液的长期稳定。这表明CAE-BLP可能在乳液形成初期更具优势，而UAAE-BLP则可能提供更好的长期储存稳定性。
3.7. SDS-Page
SDS-PAGE电泳图谱显示，两种方法提取的BLP均主要由分子量约为55 kDa和14-15 kDa的条带主导，这分别对应植物绿叶中主要的可溶性蛋白——Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）的大亚基和小亚基。这表明提取物中的主要蛋白质成分是Rubisco。
3.8. 氨基酸组成
氨基酸分析表明，UAAE-BLP的必需氨基酸和非必需氨基酸总量均显著高于CAE-BLP，特别是甲硫氨酸和赖氨酸等含量有显著提升。这表明UAAE技术可能更有效地提取出氨基酸组成更完整、营养价值更高的蛋白质组分。
3.9. 体外消化
体外蛋白质消化率（IVPD）测定结果显示，UAAE-BLP和CAE-BLP的IVPD值非常接近（分别为67.07%和66.22%），无显著差异，且均高于文献报道的许多其他绿叶蛋白。这表明BLP具有良好的可消化性，超声波处理并未对其生物可利用性产生不利影响。
综上所述，本研究成功地将超声辅助碱法提取（UAAE）技术应用于甜菜根叶蛋白的提取，并通过系统优化显著提升了提取效率和蛋白品质。研究结果表明，与传统碱法提取（CAE）相比，UAAE不仅能获得更高的蛋白得率和纯度，还能诱导蛋白质发生有益的结构变化，如提高结晶度、形成更均匀致密的微观结构、增强表面电荷等。这些结构上的优化进一步转化为改善的功能特性，包括良好的乳化稳定性、起泡性以及优异的体外消化率。更重要的是，UAAE-BLP显示出更丰富的氨基酸谱。这些发现有力地证明了UAAE是一种高效、可行的绿色提取技术，能够从甜菜根叶这一农业副产物中生产出高质量的植物蛋白。该研究为甜菜根叶蛋白的资源化利用提供了坚实的技术支持和理论依据，对开发新型可持续的植物基食品配料、推动食品体系的绿色转型具有重要意义。甜菜根叶蛋白有望成为素食食品、营养补充剂和医药领域中一种有价值的可持续蛋白质新来源。
