《SCIENCE ADVANCES》：Lrrn-mediated retinal ganglion cell targeting drives visual circuit assembly for brightness and contrast detection
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本研究针对视觉系统中亮度与对比度处理回路组装机制不清的问题，通过构建新型转基因斑马鱼模型，揭示了Lrrn2和Lrrn3a细胞黏附分子在调控视网膜神经节细胞精确靶向视顶盖最深层的核心作用。结合超微结构重建与功能成像，研究阐明了该回路在亮度信息处理中的关键功能，并将分子机制与视觉引导行为直接关联，为理解视觉回路发育提供了重要见解。
在复杂的神经系统中，精确的神经元回路组装是感觉信息处理和行为产生的结构基础。亮度与对比度作为视觉的基本特征，对于物体检测、环境导航和觅食等行为至关重要。然而，调控这些视觉特征处理回路形成的发育和分子机制，长期以来只有部分被了解。特别是在脊椎动物视觉系统中，投射到大脑视顶盖最深层的视网膜神经节细胞及其形成的微回路，由于成像和遗传靶向技术的限制，一直缺乏深入的表征。
在这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究中，研究人员利用斑马鱼这一光学透明且遗传易操作的脊椎动物模型，揭示了亮度和对比度处理回路组装的关键机制。研究团队首先构建了一个新型转基因报告品系Tg(gfi1ab:gal4)，该品系能够特异性标记投射到视顶盖最深层层状结构——白质中央层/脑室周围层（SAC/SPV）的视网膜神经节细胞（RGCs），为高分辨率解析这一先前未被充分认识的脊椎动物视觉回路提供了有力工具。
研究团队发现，富含亮氨酸重复序列的神经元（Lrrn）细胞黏附分子（CAMs）家族成员，包括Lrrn2和Lrrn3a，在此过程中扮演了关键角色。通过CRISPR-Cas9介导的基因敲除技术，研究人员证明了Lrrn2和Lrrn3a是SAC/SPV投射性RGCs在视顶盖内实现精确轴突靶向所必需的。基因敲除实验表明，缺失Lrrn2和Lrrn3a会导致视觉回路的组织结构紊乱以及亮度和对比度敏感性的损伤，进而引起视觉引导行为的缺陷。
研究人员为开展本研究用到以下几个主要关键技术方法：
研究利用新型转基因斑马鱼品系进行高分辨率回路图谱绘制；采用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除模型以研究基因功能；通过细胞移植实验分析Lrrn分子的细胞自主性与非自主性作用；利用体外蛋白聚集试验探究Lrrn分子的同嗜性和异嗜性相互作用；结合电子显微镜（EM）数据集进行超微结构连接组重建；运用双光子钙成像技术记录视觉刺激下神经元的活性；并通过行为学实验（如捕食行为分析和视动反应测试）评估视觉功能。
Shedding light onto deep-projecting RGCs
研究人员利用Tg(gfi1ab:gal4)报告品系，成功标记了视顶盖各层（包括SAC/SPV层）的RGCs。通过多重杂交链式反应（HCR）等技术，发现Lrrn2、Lrrn3a和Lrrn3b在RGCs中呈现部分重叠的表达模式，且与转录因子Gfi1ab存在共表达关系。
Genetic loss of gfi1ab and lrrn2/3a leads to mistargeting defects in the deep-OT
基因功能缺失实验表明，gfi1ab的缺失会导致lrrn2和lrrn3a mRNA表达水平显著下调。lrrn2和/或lrrn3a的单敲除（SM）和双敲除（DM）幼虫均表现出SAC/SPV层RGC轴突靶向的特异性缺陷，而投射到浅层（如SO、SFGS）的RGCs则未受影响。DM幼虫中，超过60%的深投射RGCs出现错误布线。进一步的突触定量分析显示，DM幼虫的SAC/SPV投射轴突虽然能形成稳定突触，但其突触密度因轴突长度增加而显著降低。
Deep-targeting SAC/SPV RGCs molecular requirements for proper axonal projection
细胞移植实验揭示了Lrrn2和Lrrn3a在轴突靶向中的双重作用机制：它们不仅细胞自主性地作用于RGCs本身，也非细胞自主性地依赖于视顶盖内的环境。体外蛋白聚集试验证明Lrrn2和Lrrn3a既能通过同嗜性结合，也能通过异嗜性结合发生相互作用。
SAC/SPV-projecting RGCs and intertectal neurons converge onto OT projection neurons
通过对电子显微镜数据集的分析，研究人员重建了SAC/SPV轴突在视顶盖内的详细形态和突触连接。研究发现，RGCs的轴突-树突输入主要靶向非分层化的脑室周围中间神经元（nsPVINs）和投射神经元（nsPVPNs），且偏向于兴奋性神经元。研究还发现，跨顶盖连合神经元（ITNs）和SAC/SPV-RGCs会汇聚到相同的PVPNs上，这些PVPNs大部分投射到后脑并与网状脊髓神经元形成联系。
SAC/SPV-projecting RGCs are sensitive to luminance changes
功能钙成像分析显示，SAC/SPV层对亮度变化，尤其是亮度降低（如暗闪光、暗斜坡刺激）表现出强烈的激活反应，但对方向或朝向没有选择性编码。这表明该层在亮度信息处理中具有特殊作用。
Altered SAC/SPV projections lead to impairments in brightness and contrast detection
行为学分析表明，DM幼虫和gfi1ab-/-突变体在捕食序列中，虽然能够启动狩猎并跟踪猎物，但在猎物进入攻击区后发起捕获游泳（capture swims）的关键步骤存在显著缺陷。在视动反应（OMR）测试中，突变体幼虫对低对比度（20%和10%）移动条纹的反应距离和速度显著低于野生型对照，而对高对比度条纹或小尺寸条纹的反应正常，表明其存在特定的亮度和对比度感知缺陷。
研究结论与意义
本研究首次明确了Lrrn2和Lrrn3a作为Gfi1ab下游的关键分子，在引导RGCs轴突精确靶向视顶盖SAC/SPV层中的核心作用。研究不仅绘制了此前特征不明的深投射视觉微回路，还将回路组装的具体分子机制（Lrrn CAMs）与特定的视觉功能（亮度/对比度处理）及行为输出（捕食、OMR）直接联系起来。这项工作从遗传、发育、解剖、功能和行为多个层面，系统地阐明了脊椎动物视觉系统中一条核心处理通路的发生机制，为理解神经回路特异性组装的普遍原理提供了重要范式。所发现的Lrrn CAMs在视觉系统发育中的保守功能，也为了解相关神经系统疾病的病理机制提供了新的视角。
