《SCIENCE ADVANCES》：Mitochondrial heterogeneity drives the evolution of fungicide resistance in Phytophthora sojae, with associated fitness trade-offs
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为破解QoSI类杀菌剂ametoctradin抗性“进化黑箱”，团队以大豆疫霉为模型，联合适应性实验室进化与DdCBE线粒体碱基编辑，首次证实PsCytb突变通过线粒体杂合性动态累积驱动抗性梯度形成，并揭示TFAM1介导的补偿机制可部分抵消适合度代价，为抗性风险评估与综合管理提供理论依据。
在农业生产中，杀菌剂抗性被比作“邪恶的问题”：一旦暴发，年损失可高达百亿美元，全球粮食安全与生态平衡随之动摇。QoSI（醌内外抑制剂）类代表ametoctradin因可同时占据细胞色素bc复合体的Qo与Qi位点，被寄望为“最后防线”，但大豆疫霉（Phytophthora sojae）对其抗性如何从无到有、从低到高，一直缺乏可直接验证线粒体点突变功能的工具，也弄不清“抗性增强是否一定伴随适合度骤降”的权衡规律。更棘手的是，抗性源头究竟是田间早已存在的“潜伏者”（standing variation），还是药剂诱导下的“新兵”（de novo mutation），学界陷入“先有鸡还是先有蛋”的争论。
为回答上述难题，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究中，设计了一条“进化-编辑-溯源-补偿”的完整证据链。首先对3株野生大豆疫霉进行52代、含药浓度逐级升高的适应性实验室进化，追踪约2.6万后代，发现敏感株比例逐代下降，中低抗株先升后降，高抗株最终称霸，且Ps60株系比另两株早3代出现抗性。随后利用新建立的DdCBE（DddA-derived cytosine base editors）线粒体碱基编辑平台，精准引入PsCytb第98位C→T突变，直接证明PsCytb足以赋予高水平抗性；分子动力学模拟显示突变后结合自由能从23.63降至21.68 kcal·mol，药物结合力削弱。接着，通过AS-PCR、焦磷酸测序和微滴式数字PCR（ddPCR）量化线粒体杂合性，发现突变mtDNA占比与EC值正相关；在无药条件下传代，中低抗株的突变比例和抗性均回退，说明ametoctradin选择压力是维持杂合性的“护城河”。溯源10株野生分离株，仅在Ps60中检测到0.52%的T等位基因，且该株在进化实验中率先产生高抗群，证实抗性起源可同时遵循“潜伏者”与“新兵”两条路径。最后，转录组与功能实验揭示，PsCytb导致线粒体肿胀、膜电位下降、ROS飙升、bc复合体活性降低，综合适合度指数（CFI）显著下降；而核编码的线粒体转录因子A1（TFAM1）上调，可通过增加mtDNA拷贝数部分恢复CFI，但不影响杂合性水平，形成“抗性-代价-补偿”的权衡模型。
关键技术方法：1. 适应性实验室进化（52代浓度梯度筛选）；2. DdCBE线粒体碱基编辑（构建TALE-DddA-UGI系统）；3. AS-PCR+ddPCR线粒体杂合性定量；4. 分子动力学模拟药物-蛋白结合；5. RNA-seq与TFAM1过表达/敲低验证补偿机制。
研究结果：
抗性演化轨迹：连续药剂选择下，敏感株递减，中低抗株充当过渡，高抗株终成主流，且Ps60株系因天然含0.52%突变，抗性出现更早。
PsCytb突变导致抗性：DdCBE精准编辑证实该突变直接降低药物结合力，赋予≥100倍抗性。
线粒体杂合性决定抗性程度：突变mtDNA占比与EC线性相关；无药培养45代，中低抗株突变比例下降，抗性回退。
抗性起源“鸡与蛋”共存：田间低频突变（standing variation）与实验室de novo突变共同驱动抗性。
抗性-适合度权衡：突变引发线粒体功能障碍，CFI下降30–50%；TFAM1过表达提升mtDNA拷贝数，CFI恢复约40%，但不改变杂合性。
结论与讨论：该研究首次用线粒体碱基编辑直接验证植物病原卵菌的mtDNA点突变功能，揭示“线粒体杂合性动态”是抗性由低到高演化的核心驱动力，澄清了“潜伏者+新兵”双重起源，提出“选择压力-杂合性-适合度代价-核补偿”四维权衡模型。由于Cytb在卵菌中高度保守，该机制可望推广至葡萄霜霉、黄瓜霜霉等作物病害，为制定“轮换用药-切断选择压力-利用适合度代价”的综合治理策略提供分子标尺，也为监测田间低丰度抗性突变提供了AS-PCR+ddPCR技术组合。
