《International Journal of Food Properties》：Screening of dominant microbial communities and their regulatory mechanisms on tea quality transformation during pile-fermentation of Tianjian dark tea
引言
天尖黑茶作为湖南安化黑茶的重要品类，属于安化黑茶“三尖”等级之一，传统采用初夏采摘的一芽三叶嫩梢原料制成。与茯砖茶（强调“金花”冠突散囊菌）和千两茶（竹篓包装为特色）等其他湖南黑茶不同，天尖茶以适度的渥堆发酵、茶多酚向茶褐素的平衡转化以及卓越的陈化潜力为特征，使其成为长期贮藏和价值提升的理想选择。作为一种典型的后发酵茶，其品质形成高度依赖于渥堆发酵和后续陈化过程。与其他茶类通过杀青终止酶促反应不同，黑茶在渥堆过程中通过微生物参与实现内含物的深度转化，形成其独特的色、香、味特征。然而，传统生产主要依赖经验控制，导致品质不稳定、生产周期长且品质形成机制不明确，严重制约产业标准化进程。近年来，代谢组学与微生物组学的进展开始阐明原料茶化学与微生物群落组装之间的复杂相互作用，揭示茶品质是化学-微生物相互作用主动塑造的结果，而非被动由环境因素决定。
渥堆发酵涉及的微生物群落主要包括细菌、酵母和霉菌，通过胞外酶系统催化大分子物质（如茶多酚、儿茶素、蛋白质和多糖）的降解与转化，生成茶黄素、茶红素和茶褐素等特征品质成分。这些微生物不仅影响茶叶色泽和滋味，还通过代谢产物赋予独特的陈香。作为黑茶的主要色素成分，茶褐素的形成机制与健康益处受到广泛关注。虽然黑茶发酵的微生物研究显著扩展，但针对天尖黑茶的研究与其他黑茶品种相比仍然有限。大多数研究集中于茯砖茶或四川黑茶，仅有少量研究提供了安化黑茶微生物群落的见解。近期整合微生物组与代谢组分析的多组学研究成功鉴定了核心功能微生物（如曲霉属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属），并阐明了它们在渥堆发酵过程中多糖降解和风味化合物形成中的作用。此外，控制性接种黑曲霉已被证明可加速发酵进程，同时促进茶褐素积累并通过靶向代谢物生物转化改善滋味轮廓。这一空白凸显了在天尖黑茶发酵中进行菌株特异性功能表征的必要性。尽管先前研究已分离鉴定出发酵微生物，但关于特定功能菌株如何影响品质成分转化、菌株间协同机制以及利用优势微生物群落进行定向品质调控的系统研究仍显不足。采用定量代谢组学的长期陈化研究揭示了类黄酮代谢和酚类聚合的动态转化，这些转化有助于特征性醇和陈香的形成，且贮藏时间比环境条件具有更大影响。
本研究旨在系统研究天尖黑茶渥堆发酵和陈化过程中的品质变化。研究目标包括：表征渥堆发酵（0–24 h）和陈化（0–12 y）过程中茶多酚、儿茶素和色素的动态变化；分离和评估用于品质转化的关键菌株；建立微生物复合菌剂；开发一个整合时间动态（渥堆发酵小时数和陈化年份）、微生物演替模式和品质参数演变的“时间-微生物-品质”三维调控模型，以预测和控制最终产品质量。采用整合微生物学、生物化学和分析方法监测不同采摘期、发酵时间和陈化期限的品质变化。通过脱色试验和生长动力学评估菌株功能。利用相关性和主成分分析（PCA）分析接种发酵与自然发酵的品质差异。
材料与方法
茶叶材料来源与加工
茶叶材料采自湖南省安化县的天尖黑茶生产基地，使用树龄15至20年的茶树（Camellia sinensis var. sinensis cv. Yuntaishan群体）。一芽三至四叶的样品分别于三月、四月、五月和六月采集。天尖黑茶品质标准（GB/T 32719.1–2016）规定：水浸出物≥35%，茶多酚12–18%，茶褐素≥3.5%。四月至六月采摘在嫩度（四月：氨基酸较高）和成熟度（六月：糖分较高）之间提供最佳平衡，其中五月代表传统标准。
样品收集与制备
鲜叶经过萎凋（8 h, 25°C, 60–65% RH）、杀青（260°C, 3 min）、揉捻（30 min）和初烘（90°C）制成毛茶，作为渥堆发酵的半成品基质。将毛茶水分调节至28–30%，堆高60 cm，在温湿度控制的发酵室（25–28°C, 75–80% RH）中进行发酵。在发酵0、6、12、18和24 h（W0-W24）从堆心（距表面30 cm深度，距堆边30 cm）采集样品（500 g），立即液氮冷冻并储存于-80°C直至分析。对于陈化研究，将发酵24 h的茶叶在温湿度控制的贮藏室（25 ± 2°C, 60–65% RH）中自然陈化。收集2012年至2024年的年度样品，代表0、4、6、8、10和12年陈化（C0-C12），其中C0为发酵24 h未陈化茶。制备三个对比样品：CK0（基线，等同于C0）、CK5（自然发酵，5年陈化）和JZ5（接种L2:C1:C2 = 1:1:2复合菌剂，5年陈化）。所有样品在60°C热风干燥箱中烘干，用高速粉碎机粉碎至40目，储存于-20°C冰箱直至分析。
化学品与试剂
试剂包括Folin-Ciocalteu试剂、儿茶素标准品（C, EC, EGC, EGCG, ECG）、咖啡碱、茶黄素、茶红素和茶褐素标准品（Sigma-Aldrich）；HPLC级甲醇和乙腈（国药集团）；NA、PDA、YPD培养基（北京奥博星）；DNA提取试剂盒和PCR试剂（天根）；16S rDNA和ITS引物（生工生物）。
渥堆发酵与陈化
将三月、四月、五月和六月的毛茶水分调节至28–30%，堆高60 cm，维持在25–28°C，相对湿度75–80%。使用水分分析仪监测水分含量并通过调节加湿速率和通风进行控制。在发酵0、6、12、18和24 h后从堆心（距表面30 cm深度，距堆边30 cm）采集样品。
微生物分离与鉴定
从堆心（距表面30 cm深度，距堆边30 cm）温度（26 ± 1°C）和湿度条件最稳定的茶样中分离微生物。将每个时间点（0、6、12、18、24 h）的10克样品在90 mL无菌生理盐水（0.85% NaCl）中高速匀浆，并进行系列稀释。采用稀释涂布法分离微生物：细菌用NA培养基（37°C）、酵母用YPD培养基（28°C）、霉菌用PDA培养基（28°C）。根据菌落形态、出现频率和生长优势，纯化优势菌株并通过16S rDNA测序（细菌）和ITS区测序（真菌）进行鉴定。
化学分析
水浸出物采用全量法测定（GB/T 8305–2013）：2 g磨碎样品用200 mL沸蒸馏水在100°C水浴中提取45 min，偶尔摇荡，用Whatman No. 1滤纸过滤，残渣再提取一次。合并滤液在已称重的瓷皿中蒸发，并在103 ± 2°C干燥箱中干燥至恒重。水浸出物（%）=（浸出物重量/样品重量）× 100。茶多酚采用Folin-Ciocalteu法通过紫外-可见分光光度计测定；儿茶素采用HPLC（C18柱，280 nm）测定；氨基酸采用茚三酮法测定；咖啡碱采用紫外法（272 nm）测定；黄酮类化合物采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定；可溶性糖采用蒽酮法（620 nm）测定；茶色素采用系统分析法测定。
微生物评价
脱色试验测定D/d值以评估茶多酚降解能力；生长曲线通过酶标仪监测600 nm吸光度（OD600）；菌丝体生物量干燥称重；通过接种茶汤培养基并定期测定茶多酚、黄酮、儿茶素和茶色素的变化来评估转化能力。
数据处理与统计分析
实验重复三次，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 26.0进行单因素方差分析和Duncan多重范围检验（p < 0.05）。相关性分析采用Pearson法，主成分分析使用Origin 2021进行。进行多项式回归分析以模拟陈化过程中的品质演变。通过一阶导数分析（dY/dt）确定拐点（品质改善速率下降处）来确定最佳陈化期限。测量时间点之间的插值使用二次拟合，接受标准为R2 > 0.90。
结果
原料品质特征
三月、四月、五月和六月采摘的鲜叶（加工前原料）品质成分分析显示显著差异。水浸出物含量从三月的42.15%下降至六月的36.82%。茶多酚同样从29.36%下降至24.17%。总儿茶素遵循相同趋势，主要儿茶素单体表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）从3.85 mg/g下降至2.41 mg/g。游离氨基酸在四月达到峰值（4.26%）后逐渐下降。咖啡碱相对稳定在3.2–3.5%。可溶性糖从三月的1.95%略微增加至六月的2.43%。总黄酮维持在1.8–2.0%。茶色素中，茶黄素和茶红素变化极小，而茶褐素随采摘期推迟略有增加。考虑发酵潜力，三月和四月原料具有高茶多酚和儿茶素，提供了良好的发酵基础；五月和六月原料尽管茶多酚较低，但增加的可溶性糖有利于微生物生长。总体而言，四月原料表现出最平衡的发酵品质。虽然茶多酚（27.84%）适度低于三月（29.36%），但此水平是最佳的，因为过高的多酚会导致涩味过重且发酵控制困难。结合峰值氨基酸含量（4.26%），四月原料提供了理想的基质——足够的茶多酚用于微生物转化而无过度苦味，同时高氨基酸贡献鲜味和甜味，实现了发酵潜力与最终品质之间的最佳平衡。
渥堆发酵过程中的品质变化
基于以上分析，选择具有优越品质平衡的四月原料进行渥堆发酵动态研究（样品W0-W24）。发酵期间品质成分发生显著变化。茶多酚和总儿茶素呈现快速下降。茶多酚在发酵期间下降41.3%，其中W0-W6期间降解速率最快（6 h内4.32%），随后逐渐减慢。总儿茶素从10.42%下降至5.47%，减少47.5%。儿茶素单体变化各异：EGCG和ECG降解最显著，分别从2.85和3.76 mg/g下降至1.12和1.95 mg/g；EGC从3.24下降至2.42 mg/g；C和EC相对稳定在0.07–0.08和1.01–1.03 mg/g。
茶色素转化表现出明显的阶段性特征。茶黄素在0–6 h略微增加（0.03%至0.04%），随后快速降解至24 h后的0.01%。茶红素在0–12 h快速积累（1.48%至1.82%），随后在12–24 h稳定。茶褐素从1.75%持续增加至3.23%，增长84.6%，成为主要茶色素成分。
其他品质成分变化相对温和。水浸出物略微下降（40.68%至35.67%）；游离氨基酸保持稳定（3.85%至3.92%）；总黄酮略微增加（1.88%至1.95%）；可溶性糖先下降后稳定（2.08%至1.72%）。这些成分的相对稳定性为后续陈化提供了物质基础。
陈化过程中的品质变化
基于渥堆发酵结果，选择具有大量茶褐素积累（3.23%）的24 h发酵样品（C0）进行长期陈化实验。品质成分在陈化过程中呈现不同的演变模式。水浸出物和茶多酚呈现相反趋势。水浸出物从35.67%（C0）逐渐增加至43.00%（C12），增长20.6%，前6年增长较快随后稳定。茶多酚从16.35%持续降解至8.30%，减少49.2%，呈现先快后慢模式，前6年年均降解1.34%，之后（6–12年）为0.88%。
茶褐素演变呈现分化。茶黄素维持在极低水平（0.02–0.03%）；茶红素在前4年略微增加（1.85%至2.12%），随后缓慢下降至1.68%；茶褐素从3.23%持续增加至5.85%，增长81.1%，成为陈茶的主要色素。
儿茶素和其他成分变化各异。总儿茶素从5.47%持续下降至2.85%，减少47.9%。游离氨基酸初期略微下降（3.92%至3.45%），6年后稳定。咖啡碱相对稳定在3.15–3.25%。总黄酮先下降后增加，6年时达到最低（1.56%），12年时恢复至1.82%。可溶性糖在0–6年增加（1.72%至2.35%），随后略微下降并稳定在2.20%左右。
基于陈化数据的多项式回归分析，通过确定二次回归曲线的顶点（一阶导数为零）来确定最佳陈化期限。二次拟合曲线显示水浸出物在5–6年后达到平台期（R2 = 0.96），而茶多酚在此期间稳定在12–14%（R2 = 0.94）。茶褐素积累速率（dTB/dt）在6年后显著下降，表明超过此点后收益递减。虽然未收集5年样品，但基于6个时间点（水浸出物y = -0.82x2 + 7.65x + 35.67）的数学模型预测5–6年代表了品质改善与陈化效率之间的最佳平衡。数学模型预测茶褐素在5–6年将达到4.5–4.8%，与JZ5样品5年后显示4.86%一致。
功能微生物筛选
从发酵0、6、12、18和24 h的茶样中，分离出45株细菌、18株酵母和12株霉菌。根据菌落形态、出现频率和生长优势，选择6株优势菌株进行详细研究。细菌中分离到两株克雷伯菌（L1和L2），呈圆形、乳白色、光滑的革兰氏阴性短杆菌菌落。16S rDNA序列分析显示与肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的相似性分别为98.5%和99.2%。两株酵母菌（Y1和Y2）形成圆形、凸起、白色至淡黄色菌落。内部转录间隔区（ITS）测序鉴定Y1为酿酒酵母，Y2为假丝酵母属，相似性分别为99.1%和98.7%。两株曲霉（C1和C2）初始形成白色菌落，后期变为黄绿色和深褐色。形态学和ITS序列鉴定确认C1为黄曲霉，C2为黑曲霉，序列相似性均超过99%。
脱色试验评估了茶多酚降解能力。黑曲霉C2显示最高的D/d值（1.16），表明最强的降解能力，其次是黄曲霉C1（1.12）和克雷伯菌L2（1.11）。酵母Y1的D/d值为1.09，克雷伯菌L1为1.04，酵母Y2最低（1.00），基本无脱色能力。选择D/d值高于1.10的菌株（L2, C1, C2）作为关键功能菌株进行转化实验。
生长特性
对6株选定菌株的生长动力学和转化能力研究揭示了不同的生长和转化特性。生长曲线显示细菌生长快于真菌。克雷伯菌L2在0–12 h快速生长，OD600从0.016增加至1.82，24 h达到稳定期（2.156）；L1生长稍慢，24 h OD600为1.89。酵母Y1和Y2生长相对缓慢，48 h后OD600分别为1.42和1.18。黑曲霉C2菌丝生物量呈S形生长，从8 h的0.0035 g/L增至72 h后的3.85 g/L；C1生物量稍低，72 h后为3.24 g/L。
茶多酚降解实验显示黑曲霉C2具有最强能力，48 h后将茶多酚从8.83 mg/mL降至5.12 mg/mL，降解率42.0%；克雷伯菌L2次之，为38.5%；C1和L1分别为35.2%和30.6%；酵母降解能力较弱，Y1和Y2仅分别为18.3%和12.5%。降解速率在0–24 h最快，随后减慢。
黄酮和儿茶素转化差异显著。黄酮含量在细菌作用下略微下降（1.95→1.68 mg/mL），在酵母作用下保持稳定（1.95→1.82 mg/mL），在曲霉作用下先降后升（1.95→1.58→1.78 mg/mL）。儿茶素被所有菌株显著降解，黑曲霉C2显示最高降解率（58.6%），其次是C1（52.3%）和L2（48.5%）。
茶色素转化显示菌株特异性。黑曲霉C2和C1促进大量茶褐素形成，48 h时分别达到4.86%和4.35%；克雷伯菌L2主要促进茶红素形成（2.45%）；酵母对茶色素转化影响极小。茶黄素在所有菌株作用下快速降解至痕量水平。结果表明曲霉在茶褐素形成中起关键作用，克雷伯菌主要参与茶多酚降解和茶红素形成，而酵母主要贡献香气代谢。
微生物强化发酵的调控效果
基于筛选结果，将克雷伯菌L2、黄曲霉C1和黑曲霉C2按1:1:2比例混合，制备浓度为10? CFU/g茶的复合菌剂。在发酵6、12、18和24 h后设立接种组（C）和自然发酵对照组（W）以比较品质差异。微生物强化显著提高了发酵效率。茶多酚降解和水浸出物变化显示出明显的接种优势。接种组茶多酚降解速率比对照组快15–25%，C24组茶多酚下降至14.85%，而W24组为16.35%。对于水浸出物，接种组保持更高的保留率，C24为33.80%，而W24为32.85%，表明接种在促进大分子降解的同时更好地保留了可溶性物质。
茶色素形成显示显著差异。接种组茶褐素形成速率明显加快，C24达到4.12%，比W24（3.23%）高27.6%。茶红素在接种组保持较高水平（2.15–2.35%），而对照组为（1.85–2.05%）。茶黄素在两组中均快速降解至痕量。结果表明接种促进了定向茶色素转化。
儿茶素组分变化揭示了接种效应。EGCG和ECG在接种组降解更完全，C24分别下降至0.85和1.52 mg/g，而W24为1.12和1.95 mg/g。EGC、EC和C保持相对稳定，组间差异极小。总体而言，接种组总儿茶素降解率比对照组高18.5%，有利于降低苦涩味和增强醇厚度。
强化发酵茶的陈化品质
陈化性能评估对于验证微生物强化技术的长期效果至关重要。经过5年陈化后，接种组（JZ5）和对照组（CK5）之间存在显著的品质差异。与未陈化对照（CK0）相比，CK5显示水浸出物从33.29%增加至39.85%，茶多酚从17.36%下降至14.28%。JZ5表现更优，水浸出物达到41.56%，比CK5高4.3%；茶多酚下降至12.85%，显示更完全的降解。对于茶色素，JZ5茶褐素达到4.86%，高于CK5的4.25%，表明接种茶在陈化过程中茶褐素积累更充分。
氨基酸组成分析显示JZ5总氨基酸（3.82%）超过CK5（3.56%）。主要风味氨基酸茶氨酸在JZ5中达到1.85%，占总氨基酸的48.4%；鲜味氨基酸谷氨酸（0.52%）和天冬氨酸（0.38%）也超过对照水平。甜味氨基酸，包括精氨酸、丝氨酸和苏氨酸在JZ5中分别为0.28%、0.15%和0.12%，均高于CK5。这种氨基酸富集有利于增强鲜爽度和醇厚度。
品质稳定性分析表明接种茶在陈化过程中品质变化更稳定。从CK0到CK5的茶多酚降解率为17.7%，而接种组在相同陈化条件下为15.2%，表明接种奠定了更稳定的品质基础。综合评价显示微生物强化不仅改善了即时品质，也为后续陈化奠定了优异基础，其陈化品质优于传统自然发酵。
为评估微生物接种对茶品质的长期影响，比较了三个关键样品：CK0作为基线参考（发酵24 h未陈化），CK5代表传统自然发酵陈化5年，JZ5代表接种发酵陈化5年。这一比较允许同时评估陈化效应和微生物强化的持续益处。
品质参数间的相关性
CK0、CK5和JZ5样品品质成分的相关性分析揭示了显著关系。陈化期间，茶多酚与水浸出物呈显著负相关（r = -0.89, p < 0.01），表明降解产物贡献了水浸出物增加。茶褐素与陈化程度高度相关（r = 0.94, p < 0.01），可作为关键的陈化品质指标。与CK5相比，JZ5显示更完全的茶多酚降解（12.85% vs 14.28%）、更大的茶褐素积累（4.86% vs 4.25%）和更好的氨基酸保留（3.82% vs 3.56%），证明了通过接种改善了陈化品质。
主成分分析显示前两个主成分的累积方差贡献率为89.2%（PC1: 67.5%, PC2: 21.7%）。这超过了食品科学应用中可靠解释的常用阈值80–85%，表明所选成分充分代表了原始数据结构。仅两个主成分的高方差解释度表明品质参数间存在强相关性且处理区分清晰。在PCA得分图中，三个样品清晰分离：CK0位于PC1负方向，代表未陈化状态；CK5和JZ5位于PC1正方向，指示陈化品质；JZ5在PC2方向正向移动，与CK5分离，表明接种发酵带来的独特品质特征。载荷图显示PC1主要由茶多酚（-0.45）和儿茶素（-0.42）的负载荷，以及茶褐素（0.43）和水浸出物（0.40）的正载荷决定，反映了陈化程度。PC2由氨基酸（0.48）、可溶性糖（0.41）和黄酮（0.35）贡献，代表品质丰富度。JZ5在PC2的正向移动表明更丰富的氨基酸和风味化合物。
讨论
渥堆发酵期间的品质变化
观察到的阶段性茶多酚降解（0–24 h减少41.3%）与先前在安化黑茶中的多组学研究结果一致。然而，本研究中0-6 h的快速降解速率（6 h内4.32%）超过了报道值，可能源于四月原料的高酶活性。对四川黑茶发酵车间空气微生物的监测支持了6 h后微生物占主导地位的观察。快速的初始降解（0–6 h）对应于茶叶中残留的多酚氧化酶和过氧化物酶活性，尽管经过杀青仍部分保持活性。6 h后，微生物酶（特别是来自曲霉的酶）接管，这由生长曲线与降解速率之间的相关性所证明。这种酶促演替理论解释了双相降解动力学。
茶色素转化模式与先前研究一致，发现曲霉优势（64.11%）直接影响茶色素形成速率。本研究中24 h茶褐素增加84.6%超过了六堡茶中报道的65%，验证了天尖黑茶优越的茶褐素形成能力。6 h后茶黄素的快速消失与早期微生物酶活化相关，为发酵控制提供了新的监测点。茶黄素快速消失的机制涉及化学氧化和微生物生物转化。茶黄素作为最小且反应性最强的茶色素，通过真菌多酚氧化酶催化的氧化偶联反应聚合形成茶红素并最终形成茶褐素，这与描述的类美拉德反应途径一致。
陈化过程中的驱动因素
陈化品质演变模式与在20年陈青砖茶中的发现相呼应。他们通过LC-MS鉴定了47种关键代谢物，包括甲基化儿茶素和糖基化黄酮，解释了本研究中观察到的水浸出物增加（20.6%）和茶多酚降解（49.2%）。然而，本研究确定的最佳陈化期限5–6年早于先前提出的10年，可能由于不同的初始渥堆发酵程度——充分的渥堆发酵加速了后续陈化。陈化期间水浸出物增加的机制涉及大分子的逐渐水解。细胞壁多糖在温和酸性条件（pH 5.5–6.0）下经历缓慢的酶促和非酶促降解，释放可溶性寡糖。同时，蛋白质-多酚复合
