《Research》：Regulation of Pore Evolution via Progressive Electroporation Enhanced Intracellular Molecule Transport
编辑推荐：
本研究针对传统单脉冲电穿孔技术在siRNA体内递送效率低的问题，提出渐进式电穿孔(PEP)策略。通过高压微秒脉冲(HSP)与低压毫秒脉冲(LLP)的组合，实现膜穿孔过程与分子递送过程的解耦，调控膜孔闭合动力学。实验证明PEP可延迟膜孔闭合时间约4分钟，使siRNA敲除效率达57%（与化学转染55%相当），同时将细胞活性提高至70%（化学法43%），能耗降低17%。该研究为开发新一代穿戴式递送系统提供了新思路。
基因治疗尤其是小干扰RNA(siRNA)疗法在基础研究和临床应用领域展现出巨大潜力，然而细胞膜穿透障碍和内涵体逃逸效率低等问题严重制约了核酸药物的发展。与传统病毒载体和化学载体相比，基于脉冲电场的电穿孔技术因其适用性广、操作简便等优势成为最有前景的非病毒 intracellular delivery 平台之一。但传统单脉冲电穿孔技术存在明显局限：单一脉冲类型难以兼顾递送效率与细胞活性，特别是在体内siRNA递送应用中，高siRNA浓度带来的细胞毒性要求必须在降低剂量的前提下实现高效递送。
针对这一难题，复旦大学研究团队在《Research》杂志发表了题为"Regulation of Pore Evolution via Progressive Electroporation Enhanced Intracellular Molecule Transport"的研究论文，提出了一种名为渐进式电穿孔(PEP)的创新策略。该研究通过巧妙组合高压微秒脉冲(HSP)和低压毫秒脉冲(LLP)，实现了对膜孔演化过程的精准调控，为高效低毒的细胞内分子递送提供了新解决方案。
关键技术方法包括：采用自建的固态Marx发生器产生可调脉冲波形；通过扫描电子显微镜直接观察电穿孔后膜孔形态；结合有限元多物理场耦合模拟分析跨膜电压(TMV)和膜孔能量景观演化；利用荧光显微镜实时追踪碘化丙啶(PI)和量子点(QDs)的细胞内转运过程；建立MDA-MB-231-luciferase异种移植瘤模型评估体内siRNA敲除效率。
研究结果方面：
PEP通过调控膜孔演化动力学增强细胞内递送
研究人员设计了五种脉冲调制模式，发现HSP+LLP3组合（750 V/cm×20 μs脉冲后接75 V/cm×100 ms脉冲）可使PI递送效率比单用HSP提高45%。通过监测不同时间点的PI透化情况，发现PEP将膜孔半衰期延长了约4分钟，为分子进入细胞提供了更长的的时间窗口。
多物理场耦合模拟阐明PEP调控机制
仿真结果显示，PEP在极化角θ=45°区域能有效延缓TMV衰减，将TMV维持在200 mV水平，从而减缓膜孔闭合速率。能量景观分析表明，残余TMV通过降低膜孔收缩过程中的能量梯度，延迟了膜孔自由能的最小化过程。
PEP调控膜孔再密封动力学及细胞活性影响
扫描电镜观察发现，BEP和PEP处理后立即形成的膜孔尺寸无显著差异，但PEP处理组的膜孔恢复时间明显延长。细胞活性实验证实，PEP在提高递送效率的同时，未对细胞活性产生显著影响。
PEP促进体外siRNA电转染效率
在MDA-MB-231-GFP和MDA-MB-231-Luciferase细胞中，PEP介导的siRNA敲除效率分别达到47%和57%，与RNAiMAX化学转染效率（55%）相当，但细胞活性显著提高（70% vs 43%）。
PEP提升体内siRNA敲除效率
在皮下移植瘤模型中，PEP组荧光素酶表达在治疗后2天下降52.3%，证实了该技术在体内的有效性。组织学分析显示，PEP对正常皮肤结构和胶原纤维分布无显著影响，具有良好的生物安全性。
讨论部分指出，与传统电穿孔相比，PEP策略的创新性在于将膜穿孔与分子递送过程解耦：HSP负责高效诱导膜穿孔，LLP则通过调控TMV衰减和膜孔能量波动来延长膜孔寿命。这种脉冲调制方式不依赖复杂的设备改造，为开发新一代低能耗穿戴式递送系统奠定了基础。
该研究的重要意义在于：首次从膜孔能量景观角度阐明了组合脉冲调控膜孔动力学的机制；证明了通过调控膜孔再密封动力学而非单纯增加穿孔数量可提高递送效率；为siRNA疗法提供了一种高效、低毒、低能耗的物理递送新策略。随着进一步优化，PEP技术有望在基因治疗、细胞治疗等领域发挥重要作用。
