《Research》：Spatiotemporal Regulation of Ligand Trafficking and TLR9 Activation by PIEZO1 in Human Plasmacytoid Dendritic Cells
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本研究揭示了浆细胞样树突状细胞(pDCs)中TLR9信号通路的新型调控机制。研究人员发现CpGA与CpGB虽同属TLR9激动剂，但因自聚集特性差异导致内吞时产生不同膜张力，进而通过机械敏感离子通道PIEZO1调控信号转导。该研究首次证实PIEZO1通过Ca2+内流和F-肌动蛋白重构将CpGA滞留于早期内体，从而增强IRF7活化和IFN-α产生，为自身免疫疾病治疗提供了新靶点。
在免疫学领域，浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)被誉为"干扰素工厂"，因其在病毒感染时可爆发性产生I型干扰素(type I interferons, IFNs)。这种能力主要依赖于细胞内体中的Toll样受体9(Toll-like receptor 9, TLR9)对核酸的识别。有趣的是，虽然合成寡脱氧核苷酸CpGA和CpGB都能激活TLR9，但只有CpGA能强力诱导IFN-α产生，而CpGB主要引发炎症因子反应。这一现象自发现以来始终是未解之谜——为何结合同一受体的化学类似物会产生截然不同的信号输出？
传统观点认为这种差异源于内体运输路径的不同：CpGA滞留在信号许可的早期内体中激活IRF7，而CpGB快速进入晚期内溶酶体激活NF-κB。然而，调控这种配体分选的上游机制一直不清楚。发表在《Research》的这项创新性研究，从生物物理角度给出了全新解释：机械力感知才是决定TLR9信号命运的关键开关。
研究人员通过多种生物物理技术发现，CpGA在生理条件下能自组装成大分子聚集体，而CpGB保持单体状态。这种尺寸差异导致内吞时产生截然不同的机械效应：扫描电镜显示CpGA处理引起显著膜皱褶，而干涉反射显微镜(interference reflection microscopy, IRM)证实CpGA内吞位点周围出现局部膜张力升高。这种机械刺激被机械敏感离子通道PIEZO1感知，触发钙内流和局部F-肌动蛋白(F-actin)重构，形成"锚定"结构将CpGA保留在早期内体中，从而延长IRF7激活时间窗。
关键技术方法包括：小角X射线散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)和荧光关联光谱(fluorescence correlation spectroscopy, FCS)分析配体聚集状态；干涉反射显微镜与全内反射荧光(total internal reflection fluorescence, TIRF)显微镜联用定量膜张力动态变化；siRNA基因敲低和药理学抑制验证PIEZO1功能；亚细胞分级分离追踪TLR9配体内体运输轨迹。研究使用从健康成人外周血分离的原代人类pDCs，确保生理相关性。
自关联倾向性CpGA配体在内化过程中引发更强膜张力
SAXS分析显示CpGA在PBS中形成约53.1 kDa的伸长聚集体，而CpGB仅9.5 kDa。FCS证实CpGA随浓度增加出现扩散时间延长和粒子数减少，表明自关联特性。尽管两者均通过CLIC-GEEC途径内吞，但扫描电镜揭示仅CpGA引起明显膜皱褶。IRM-TIRF联用成像显示CpGA内吞位点周围100纳米区域内膜张力显著提升至~1,300 pN/μm，达到已知的PIEZO1激活阈值。
CpGA诱导的膜张力通过激活PIEZO1特异性增强pDCs的IFN-α产生
共聚焦显微镜显示CpGA刺激引起PIEZO1膜聚集和簇化。药理学抑制(GsMTx4)或基因敲低PIEZO1显著降低CpGA诱导的IFN-α mRNA和蛋白表达。相反，PIEZO1激动剂Yoda1可使CpGB获得诱导IFN-α的能力，且该效应依赖PIEZO1表达。
PIEZO1激活促进CpGA在早期内体滞留和IRF7核转位
免疫荧光显示PIEZO1抑制导致CpGA与早期内体标志物EEA1共定位减少，与晚期内体标志物LAMP1共定位增加。亚细胞分级证实Yoda1处理促进CpGB在早期内体富集。核质分数分析表明PIEZO1抑制削弱IRF7核转位但增强NF-κB核转位，而Yoda1处理可逆转CpGB驱动的NF-κB活化。
PIEZO1驱动钙内流诱导局部肌动蛋白重构以稳定含CpGA的早期内体
钙成像显示CpGA和Yoda1诱导的钙内流依赖PIEZO1表达。三维共聚焦分析发现CpGA刺激下F-肌动蛋白特异富集于早期内体周围，且该效应可被PIEZO1抑制阻断。肌动蛋白聚合抑制剂PD150606消除Yoda1增强的IFN-α产生，证实细胞骨架重构的功能必要性。
该研究最终揭示了一个全新的TLR9信号调控范式：配体物理属性（如尺寸和自聚集倾向）通过膜张力-PIEZO1-钙信号-肌动蛋白重构轴，决定内体运输路径和信号输出特异性。这一发现不仅解答了CpG类别特异性信号的长期疑问，更建立了机械生物学与免疫识别的直接联系。特别是在自身免疫疾病中，自身核酸与LL37抗菌肽或自身抗体形成的大复合物可能通过类似机制过度激活pDCs，这为治疗干预提供了新思路——靶向PIEZO1可能精确调控病理性IFN反应而不影响保护性免疫。此外，该研究提示未来疫苗佐剂设计应考虑核酸药物的物理属性优化，为免疫治疗策略开发开辟了新维度。
