《mSystems》：Longitudinal long-read microbiome profiling in a canine model reveals how age, diet, and birth mode shape gut community dynamics
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本研究通过长读长16S rRNA测序技术，纵向追踪纯种匈牙利普米犬从出生至成年（81周）的肠道菌群动态，揭示了年龄是驱动微生物群落结构成熟的首要因素，其影响超过犬舍环境与性别。研究发现断奶期（3.5–6周）是菌群多样性（alpha diversity）快速提升的关键窗口，并在6月龄趋于稳定；beta多样性分析显示微生物组成随年龄增长从高变异性向成人样均匀群落转变。研究首次在犬模型中证实剖腹产分娩会显著影响早期生命菌群（如提升乳酸杆菌Lactobacillus丰度），并记录了母犬在妊娠与哺乳期的可重复性菌群变化。该成果为利用犬类转化模型研究人类微生物组发育、饮食干预及垂直传播机制提供了高分辨率数据集。
研究设计与分析方法
本研究对89只纯种匈牙利普米犬进行了纵向追踪，共收集456份粪便样本，包括55只幼犬（从出生至81周龄）、9只母犬（涵盖妊娠期与哺乳期）以及20只成年对照犬。样本来自六个独立犬舍，确保了环境背景的一致性。通过牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）对全长16S rRNA基因（V1–V9区域）进行测序，使用EMU进行物种级分类学分析，并在R语言环境中利用phyloseq等包进行多样性计算与统计建模。
微生物多样性随年龄增长而提升并在成年期稳定
非度量多维标度（NMDS）分析显示，样本点沿年龄梯度呈现明显分布规律：新生儿与早期生命样本分散较广，表明个体间变异度高；而后期样本点聚集紧密，提示微生物群落逐步收敛为成人样稳态结构（图2A）。Alpha多样性（以香农指数衡量）在生命最初几周内显著上升，尤其在断奶窗口期（3.5–6周）出现陡增，随后增长渐缓，约在6月龄时达到平台期（图2B）。效应大小分析进一步确认年龄是alpha多样性的最强预测因子（P < 0.001），犬舍因素影响较小但显著，性别则无显著贡献（图2C）。同一犬舍内不同窝幼犬间的香农多样性差异普遍不显著，仅一对窝间比较达到统计学意义（图2D）。这些结果共同表明，年龄相关的发育程序及伴随的饮食转换是群落结构的主要驱动力。
发育阶段塑造菌群分类组成
在属水平上，早期样本（0–8周）以埃希氏菌（Escherichia）、巨单胞菌（Megamonas）、乳酸杆菌（Lactobacillus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）为主；断奶后（>8周）则转变为布劳特氏菌（Blautia）、肽乙酸杆菌（Peptacetobacter）和梭杆菌（Fusobacterium）占优势。其中，布劳特氏菌在所有生命阶段均持续丰富，并随年龄稳步增加，提示其作为断奶后核心属的地位（图3A）。物种级分辨率分析揭示了最优势菌种，如高丰度的布劳特氏菌葡萄糖酶菌（Blautia glucerasea）和高流行率的布劳特氏菌汉森氏菌（Blautia hansenii）、脐粪单胞菌（Faecalimonas umbilicata）等（图3B）。系统发育树显示，前350个分类单元与年龄及犬舍来源存在显著关联（图3C）。混合效应模型进一步识别出与年龄、犬舍、饮食及性别显著相关的特定类群。
物种级核心微生物组随年龄演变
基于流行度（≥90%）定义的核心物种集分析发现，有13个物种在所有年龄组中普遍存在，其平均相对丰度随年龄发生系统性变化。这些核心物种以产短链脂肪酸（SCFA）的梭菌纲（如布劳特氏菌属、脐粪单胞菌）和具有胆汁酸转化功能的希拉诺氏肽乙酸杆菌（Peptacetobacter hiranonis）为主。成对Jaccard相似性分析显示，相邻成年阶段（如3–7岁与7–10岁）的核心菌种重叠度最高，而断奶前与成年组之间的重叠极小，凸显断奶是关键的生态转折点。
微生物共现网络随发育重新连接
SparCC推断的共现网络（Co-occurrence networks, CONs）揭示了微生物互作模式随年龄的显著变化。小于3.5周龄的幼犬网络连接稀疏；6–8周时网络密度与模块性增加，群落结构更复杂；至1–2岁龄，成年微生物组形成高度连接且稳健的网络，核心类群（如拟杆菌Bacteroides、梭菌Clostridium、萨特氏菌Sutterella）间存在强正相关（图4）。这一拓扑结构的演变反映了菌群在功能与生态上的成熟过程。
分娩方式影响早期生命菌群组成
针对同一母犬所生、同一犬舍饲养、年龄（8–10周）与饮食匹配的两窝幼犬（一窝剖腹产、一窝阴道分娩）的对比分析显示，两组在beta多样性上存在差异（图5A），但香农多样性无显著区别（图5B）。值得注意的是，剖腹产幼犬的乳酸杆菌（Lactobacillus, Padj= 0.008）和普雷沃氏菌（Prevotella, Padj= 0.038）相对丰度显著高于阴道分娩幼犬，而罗姆布茨菌（Romboutsia）丰度较低（Padj= 0.045）（图5C, D）。这一发现表明，在控制其他条件时，分娩方式可在犬类早期肠道定植中留下持久印记。
母犬肠道微生物组随生殖状态变化
母犬肠道菌群的alpha多样性在妊娠晚期和哺乳早期出现短暂下降，断奶后部分恢复（图6A）。尽管时间相近，产前与产后几天的微生物组组成存在显著差异，表现为布劳特氏菌和梭杆菌的消失以及梭菌（Clostridium）和链球菌（Streptococcus）的出现（图6B）。然而，无监督聚类分析表明，微生物组谱系更强烈地受母犬个体身份而非生殖状态驱动，且与犬舍或饮食无一致关联（图6C）。
讨论与展望
本研究通过高分辨率纵向数据证实，年龄及相关饮食转换是犬类肠道微生物组组装的首要驱动力，犬舍/窝别环境与宿主性别影响相对较小。断奶被确定为生态剧变的关键窗口，菌群关联网络拓扑结构随发育逐步重塑。研究初步揭示了分娩方式对早期定植的影响，并记录了母犬生殖期的菌群动态。这些发现支持犬类作为研究人类早期生命微生物组发育的转化模型，并强调了年龄匹配、断奶状态及围产期因素在研究设计与潜在干预策略中的重要性。未来研究需扩大剖腹产队列规模，整合宏基因组学、宏转录组学等多组学数据，并前瞻性追踪母-幼-环境三元互动，以阐明机制并指导比较医学中的靶向微生物调控。
