利用QTOF和QQQ平台上的原位碎裂技术，对葡萄酒和橡木中的可水解单宁进行高通量指纹分析

《Food Chemistry》：High-throughput fingerprinting of hydrolysable tannins in wine and oak wood using in-source fragmentation on QTOF and QQQ platforms

高效非破坏性水溶性单宁分析方法研究及其在葡萄酒橡木陈酿中的应用 | 在源碎片化 | 液相色谱-质谱联用 | 酒类分析 | 橡木陈酿评估

　　

林艳欣|潘 Bruce S.|隋罗伯特（强）|于平|克瓦斯涅夫斯基米莎 T.

美国宾夕法尼亚州立大学食品科学系，大学公园

摘要

可水解单宁，包括鞣花单宁和没食子单宁，通过橡木陈酿等方式影响葡萄酒的感官特性和抗氧化性能。然而，由于其结构多样性、低浓度以及与其他酚类物质的干扰，这些单宁的定量分析存在困难。本研究介绍了一种新型的快速液相色谱-质谱方法——可水解单宁片段化指纹图谱分析（H-TFF），该方法利用原位片段化技术来定量并初步鉴定葡萄酒和橡木中的可水解单宁。该方法在四极杆飞行时间和三极杆飞行时间质谱平台上进行了开发和验证，无需酸水解即可实现原态单宁的定量。鞣花单宁的浓度与酸水解得到的结果具有高度相关性（r > 0.92），尽管存在没食子酸酯化缩合单宁的干扰，没食子单宁的分析结果在不同平台间仍具有较好的一致性。H-TFF不仅保留了色谱分离效果，便于初步鉴定，而且结合缩合单宁片段化分析后，还能基于橡木处理方式和单宁组成对葡萄酒进行更细致的区分。总体而言，H-TFF能在6分钟内提供高效且信息丰富的单宁分析结果。

引言

可水解单宁（HTs）是与缩合单宁（CTs）并列的两种主要单宁类型（Cosme等人，2025年；Salminen，2018年）。HTs分为两大类：鞣花单宁和没食子单宁。鞣花单宁主要存在于坚果（如山核桃和核桃）以及某些水果（如石榴、草莓、覆盆子和黑莓）中（Esposto等人，2021年；García-Villalba等人，2015年；Hejduk等人，2022年；Smeriglio等人，2017年；Zhu等人，2025年）。相比之下，没食子单宁主要存在于某些木本和草本双子叶植物中，尤其是漆树和中国五倍子是这类单宁的丰富来源（Zannou等人，2025年；Zhang等人，2014年，2014年）。在葡萄酒中，HTs通常为外源性物质，主要通过橡木桶陈酿或使用橡木碎片等添加剂引入。这些化合物能够增强葡萄酒的抗氧化能力（Nikolantonaki等人，2019年），稳定花青素色素（Chassaing等人，2010年），并影响葡萄酒的口感特性（González-Centeno等人，2016年；Li等人，2020年；Navarro等人，2016年）。有趣的是，HTs能赋予葡萄酒一种平滑、丝滑的收敛感，这与缩合单宁带来的较为坚硬的口感不同（Chira等人，2015年；Michel等人，2011年；Stark等人，2010年）。先前的研究表明，HTs的感官阈值非常低，约为1.1至126.0 μmol/L（相当于约1.0–118 mg/L的vescalagin）。由于HTs同时影响化学稳定性和感官品质，因此其分析对于理解葡萄酒的组成和成熟过程至关重要；在工业应用中，快速测量方法尤为重要。然而，传统的酸水解法耗时较长且会破坏单宁的原始结构（García-Villalba等人，2015年；Inoue & Hagerman，1988年；Wilson & Hagerman，1990年），而液相色谱-质谱（LC-MS）分析受限于可用标准品的数量（Fernandes等人，2022年；Hooi Poay等人，2011年；Stark等人，2010年）。这些限制使得在复杂样品（如葡萄酒）中全面、高效地分析HTs变得困难，因此需要改进分析策略。

HTs的分析难度源于其结构多样性。鞣花单宁，尤其是C-糖苷形式的橡木单宁（见图1），具有一个葡萄糖核心（即C-1至C-6），并带有HHDP类型的酰基（Michel等人，2011年；Quideau等人，2004年），但由于取代基（图1中的1–4位）、寡聚化（图1中的7–10位）以及与黄酮-3-醇的结合（例如acutissimin A和B，见图1中的（5, 6位））而存在显著差异（Jourdes等人，2013年）。水解后它们会生成鞣花酸，这可作为鞣花单宁含量的实用标志物（García-Villalba等人，2015年；Wilson & Hagerman，1990年）。相比之下，没食子单宁由多种不同的没食子酸酯组成（通常是异构体），即使在没有明显寡聚化的情况下也会增加分析复杂性（Salminen，2018年）。

因此，常规的定量方法依赖于酸水解（AH）或LC-MS，但两者都有各自的局限性。酸水解通过释放鞣花酸和没食子酸来简化混合物，但会破坏单宁的原始结构，需要在高酸性条件下长时间加热，还需校正样品中的游离酸，并可能高估没食子酸的浓度（因为缩合单宁也会在这些条件下水解）。LC-MS可以检测完整的单宁离子并提供更高的选择性，但这受到可用标准品数量有限及相关异构体共洗脱的影响（Fernandes等人，2022年；Hooi Poay等人，2011年；Stark等人，2010年）。

鉴于这些挑战，一种能够在不破坏单宁原始结构且不依赖单一标准品的情况下提供类别级别信息的高通量分析方法将大大改善HTs的表征。电喷雾离子化过程中的原位片段化（ISF）具有这种潜力。ISF发生在电喷雾离子化（ESI）过程中，即在色谱分离后、质谱分析之前，使复杂分子部分解聚（Xie等人，2023年）。

ISF在缩合单宁的分析中已被广泛应用，它能切断黄酮间的C-C键，生成类似硫醇解/花青素解产物的片段（Engstr?m等人，2014a；Gu等人，2003年；Kennedy & Jones，2001年；Lin等人，2025年）。在HTs中，ISF也能从鞣花单宁和没食子单宁生成分别对应于鞣花酸（m/z 301）和没食子酸（m/z 169）的标记离子（Engstr?m等人，2015年）。与酸水解不同，ISF不需要长时间加热，且能保留单宁的原始色谱谱型。与传统需要前体离子优化、碰撞池片段化调节且受标准品限制的LC-MS/MS方法相比（Fernandes等人，2022年；Stark等人，2010年），ISF可以直接从色谱柱中洗脱出的所有HT结构生成特定类别的离子。

基于这一概念，本研究旨在：（1）介绍并验证一种快速、可靠的ISF方法——可水解单宁片段化指纹图谱分析（H-TFF），用于定量鞣花单宁和没食子单宁，该方法同时适用于四极杆飞行时间（QTOF）和三极杆飞行时间（QQQ）质谱平台；（2）比较传统酸水解方法与H-TFF在QTOF和QQQ仪器上的定量效果；（3）使用H-TFF方法对甲醇和葡萄酒基质中的橡木碎片提取物进行表征，以实现单宁类别级别的分析；（4）将H-TFF与现有的缩合单宁片段化指纹图谱分析（C-TFF，Lin等人，2025年）结合，生成一组经过橡木处理的葡萄酒的全面单宁组成指纹图谱。

材料与方法

图2展示了鞣花单宁和没食子单宁的H-TFF定量流程。方法开发包括标准品制备、色谱分离、数据采集、定量及QTOF和QQQ平台的后处理步骤。验证工作通过QTOF和QQQ平台之间的交叉比较以及与酸水解方法的对比来进行（使用22种红葡萄酒和20种白葡萄酒，见表S1），以评估方法的线性、检测限（LOD）、准确度、精密度和基质效应

鞣花单宁的总浓度

在酸水解过程中，样品中的鞣花单宁会被水解成鞣花酸，然后对其浓度进行定量。总鞣花单宁（ET）浓度是根据鞣花酸的产量反推计算得出的（García-Villalba等人，2015年；Wilson & Hagerman，1990年）。换句话说，鞣花酸的浓度被转换成vescalagin浓度，并以vescalagin当量（mg/L）的形式报告。

结论

本研究提出了一种新型的高通量方法，利用ISF技术对葡萄酒中的可水解单宁进行定量和初步结构表征。该方法在QTOF和QQQ平台上进行了开发和验证，能够在不破坏单宁原始结构的情况下快速、无损地分析鞣花单宁和没食子单宁，为传统酸水解方法提供了实用替代方案。此外，H-TFF的非破坏性特点保留了色谱分离结果，有助于明确单宁的分布情况。

作者贡献声明

林艳欣：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、研究设计、概念构建。潘 Bruce S.：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金筹集。隋罗伯特（强）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源调配、项目管理、概念构建。于平：撰写 – 审稿与编辑、资源协调。克瓦斯涅夫斯基米莎 T.：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。

资金来源

本研究得到了宾夕法尼亚州立大学农业科学学院Crouch葡萄栽培、酿酒学和果树研究基金以及美国葡萄园基金会（AVF）2025-2954项目的支持。此外，还获得了美国农业部（USDA）国家食品与农业研究所（NIFA）Hatch项目的资助（项目编号PEN04792，访问编号7002577）。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢Helene Hopfer博士在编辑和整合互补研究方面的宝贵帮助，也感谢我们的商业合作伙伴在整个研究过程中提供的样品、技术支持及有益讨论。同时，我们也感谢宾夕法尼亚州立大学食品科学系的同事和学生们在本研究开发过程中提供的关键意见。