葡萄糖介导的豌豆蛋白支架的Maillard交联作用，以增强其机械性能并促进肌母细胞增殖

《Food Chemistry》：Glucose-mediated Maillard crosslinking of pea protein scaffolds to enhance mechanical properties and myoblast proliferation

通过美拉德反应对豌豆蛋白 isolate 基 scaffold 进行改性，研究显示添加5%葡萄糖可显著提升其机械强度（硬度增加52.9%）、水稳定性（肿胀率降低52.4%）及细胞相容性（C2C12 细胞附着和增殖分别提高2.4倍和12.1倍），经空气炸制后仍保持结构完整性，为培养肉应用提供了食品级改性策略。

　　

崔英英|金允彬|尼廷·尼廷

加州大学戴维斯分校食品科学与技术系，美国加利福尼亚州戴维斯市 95616

摘要

基于植物蛋白的支架通常缺乏足够的水合性和机械稳定性，无法支持动物细胞的附着和增殖。本研究提出了一种使用美拉德反应（Maillard reaction, MR）的食品级交联策略。在该反应中，葡萄糖在受控加热条件下与豌豆蛋白分离物（Pea Protein Isolate, PPI）结合。通过比色法、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及机械和水稳定性分析对支架进行了表征。使用小鼠成肌细胞（C2C12）和永生化牛卫星细胞（immortalized bovine satellite cells, iBSC）评估了细胞相容性。经MR改性的支架呈现出类似肉的深红色，并显示出增强的机械强度：添加5%葡萄糖后，硬度提高了52.9%，膨胀减少了52.4%，水分降解降低了24.7%。葡萄糖的添加增强了细胞反应，C2C12的附着和增殖分别提高了2.4倍和12.1倍，iBSC的增殖提高了4.9倍。这些支架还支持C2C12细胞的肌生成分化，并在空气油炸后保持了结构完整性，突显了其在培养肉应用中的潜力。

引言

细胞农业方法是开发替代肉制品的新兴解决方案之一（Gaydhane等人，2018年；Seo等人，2023年）。这一过程通常包括从活体动物中选择适当的细胞类型，将这些细胞转化为永生化细胞系，并将这些细胞附着在食品生物材料支架上，以支持其生长和分化为脂肪或肌肉组织（Levi等人，2022年）。特别是，使用细胞农业方法开发结构化的肌肉或脂肪组织需要：（i）仔细选择可食用且生物相容的支架材料；（ii）以成本效益的方式加工支架材料，以确保其结构稳定性和对细胞附着、增殖和分化的生物支持（Cai等人，2020年）。豌豆、大豆、花生和玉米醇溶蛋白等植物来源的蛋白质已成为制造支架的有希望的候选材料（Ianovici等人，2022年；Jeong等人，2024年；Lee等人，2024年）。尽管这些蛋白质具有潜力，但由于机械强度不足、缺乏细胞附着和增殖所需的识别基序以及缺乏处理和结构化植物蛋白质的细胞相容方法，这些蛋白质在细胞农业中的广泛应用受到限制（Fang等人，2025年；Ianovici等人，2022年；Lee等人，2024年；Levi等人，2022年；Stout等人，2023年）。

在各种用于植物基生物聚合物的物理和化学交联方法中，只有少数被认为是食品级的，因此适用于培养肉生产的支架开发（Alam等人，2024年；Alavarse等人，2022年；Chng & Wan，2023年；Indurkar等人，2020年；Wei等人，2023年）。尽管酶促交联系统（如转谷氨酰胺酶和漆酶）和非酶促剂（如Genipin）显示出潜力，但在细胞培养条件下支架的机械强度不足以及相对较高的材料成本仍然是限制因素（Alavarse等人，2022年；Feng等人，2024年；Chui等人，2019年；Liu等人，2023年）。此外，使用这些方法制备的支架的细胞相容性在广泛的哺乳动物细胞中尚未得到充分证明。作为新兴的替代方案，最近的研究将植物蛋白质与高分子量多糖结合，以提高支架的机械稳定性和细胞相容性（Kim等人，2025年；Popa等人，2022年）。例如，玉米醇溶蛋白与海藻酸盐或大豆蛋白与壳聚糖的组合已被证明可以改善支架的机械性能和细胞相容性（Feng等人，2024年；Jeong等人，2024年；Wollschlaeger等人，2022年）。然而，这些策略通常需要较高的多糖含量才能在植物蛋白基质中实现显著的结构和功能改进。因此，显然需要成本效益高、食品级的方法，能够在不大量使用外源粘合剂和稳定剂的情况下提高富含植物蛋白的支架的机械完整性和细胞相容性。

美拉德反应（Maillard reaction, MR）在受控加热条件下发生在蛋白质的氨基和还原糖的羰基之间（Ma等人，2020年）。这种糖基化过程通过一系列反应促进了蛋白质的自由氨基和巯基与MR过程中产生的活性羰基中间体之间的共价交联（Zha等人，2021年；Zhang等人，2023年）。虽然MR已被广泛用于改善植物蛋白质的功能特性，如乳化、成膜和持水能力（Ma等人，2020年；Qi等人，2017年），但其增强用于培养肉生产的植物蛋白基支架的物理化学完整性的潜力尚未得到充分研究。更重要的是，MR诱导的修饰对其与哺乳动物细胞相互作用（包括附着、增殖和分化）的潜在影响仍很大程度上未得到探索。

因此，本研究旨在探讨MR作为一种非酶促的、食品级策略，用于调节用于培养肉生产的植物蛋白基支架的性能。为实现这一目标，选择了豌豆蛋白分离物（PPI）作为基础材料，因为它含有高蛋白质且广泛应用于替代蛋白质产品。选择葡萄糖这种简单的还原糖来诱导MR介导的蛋白质交联，并增强支架的物理和生化特性。进行了一系列评估，以评估葡萄糖浓度和热处理对支架性能的影响。首先，对支架的颜色和物理化学性质进行了表征，随后评估了细胞附着、增殖和分化情况。最后，在空气油炸前后分析了含有分化细胞的支架的结构完整性和外观。总体而言，本研究展示了一种新颖的、与食品相容的方法，用于工程化具有增强物理和生化特性的植物蛋白基支架，以用于培养肉应用。

材料

PPI从Terrasoul Superfoods（美国德克萨斯州福思沃思）购买。葡萄糖（>98.0%）从TCI America（美国俄勒冈州波特兰）获得。甘油、Tween-20、5%（w/v）的picrylsulfonic酸溶液和碳酸氢钠（NaHCO₃）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得。高葡萄糖含量的Dulbecco's Modified Eagle's medium（DMEM）、DMEM-Glutamax、胎牛血清（FBS）、1× DPBS、青霉素-链霉素（P/S）、抗生素-抗真菌剂（100×）、嘌呤霉素以及0.25%

颜色变化

颜色变化，特别是棕色的形成，可以作为MR发生的视觉指标（Kchaou等人，2019年）。未经加热的支架，无论葡萄糖含量如何，都保持一致的黄色，表明单独添加葡萄糖并未引起明显变化（图1A）。经过热处理后，PPI-H和PPI@GL0.1-H（图1B）仅显示出轻微的颜色变化，这可能是由于在这些条件下豌豆蛋白和葡萄糖之间的糖基化作用有限（Li等人，2014年；

讨论

在本研究中，我们评估了MR这种食品级的、非酶促策略，以增强植物蛋白支架的颜色特性、机械完整性和细胞相容性（细胞附着、增殖和分化）。葡萄糖浓度最高的PPI支架（PPI@GL5.0-H）形成的深棕色表明在加热过程中形成了糖基化产物和褐变色素，如黑色素（Kchaou等人，2019年；Sun等人，2021年；Wang等人，2011年）。

结论

本研究提出了一种食品级的、非酶促的方法，通过基于MR的交联来制造植物蛋白基支架。葡萄糖介导的MR显著影响了PPI支架的物理化学性质，使其具有更接近肉的颜色、更高的机械稳定性和更强的抗水性。这些物理化学特性受到PPI支架中葡萄糖浓度和MR过程中的热处理的影响。优化的支架（PPI@GL5.0-H）

CRediT作者贡献声明

崔英英：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、项目管理、方法论、研究、数据分析、概念化。金允彬：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法论、研究、数据分析。尼廷·尼廷：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资源管理、项目管理、方法论、资金获取。

未引用的参考文献

Cao, Fu和He, 2007

Cheng, Wang, Li, Chen和Cui, 2023

Etxabide, Kilmartin, Maté和Gómez-Estaca, 2022

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了农业和食品研究计划（AFRI）可持续农业系统项目（资助编号：2021-699012-35978）的支持，该项目由美国农业部国家食品和农业研究所提供。崔英英博士还得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部资助的基础科学研究计划的支持（NRF-RS-2023-00245688）。