一种优化的体外消化方案，用于评估植物性食品基质中的零价铁纳米颗粒

《Food Chemistry》：An optimized in vitro digestion protocol for evaluating zero-valent iron nanoparticles in plant-based food matrices

零价铁纳米颗粒（Fe(0) NPs）在模拟口腔-胃-肠道消化过程中的稳定性、转化行为及生物可及性被系统研究。采用STEM成像、单颗粒ICP-MS/MS和总铁定量技术，优化了酶浓度（唾液淀粉酶0.5 g/L，胃蛋白酶70 g/L，胰蛋白酶7 g/L），发现胃相中Fe(0) NPs溶解并团聚，肠相因中性pH条件部分恢复溶解。番茄样本显示根系铁累积最高，验证了优化消化模型的有效性。

　　

朱莉塔·诺沃萨德科（Julita Nowosadko）| 苏珊娜·希曼斯卡（Zuzanna Szymańska）| 莫妮卡·库皮茨（Monika Kupiec）| 莫妮卡·阿什特姆博尔斯卡（Monika Asztemborska）| 莉娜·鲁齐克（Lena Ruzik）

华沙工业大学，化学系，分析化学教研室，地址：Noakowskiego 3，01-664 华沙，波兰

摘要

零价铁纳米颗粒（Fe(0) NPs）在农业和食品系统中的应用日益增多，这引发了人们对它们在摄入后稳定性和生物可利用性的担忧。本研究利用STEM成像技术、单颗粒ICP-MS/MS以及总铁含量测定方法，探讨了Fe(0) NPs在模拟的口腔-胃-肠道消化过程中的变化。INFOGEST 2.0实验方案经过调整和优化，适用于含有FeNP的植物样本。唾液淀粉酶对Fe(0) NPs或植物基质的完整性没有影响。在胃酸（胃蛋白酶）的作用下，当浓度超过70?g·L^?1时，纳米颗粒会发生溶解和聚集。在中性pH值的肠道环境中，胰酶的作用部分逆转了这一过程，形成了约45?nm大小的颗粒、聚集体以及离子态铁的混合物。该方案通过富含FeNP的番茄组织和CRM番茄叶片进行了验证。铁在植物不同部位的分布存在差异，其中根部积累量最高。推荐使用以下酶浓度进行体外实验：0.5?g·L^?1的淀粉酶、70?g·L^?1的胃蛋白酶和7?g·L^?1的胰酶，以研究FeNP在食品相关植物系统中的转化和生物可利用性。

引言

纳米材料天然存在于环境中，自古以来就被无意中用作着色剂（Jeevanandam等人，2018年）。近几十年来，工程纳米材料在工业领域的应用日益广泛，包括农业（Capaldi Arruda等人，2015年；Kaningini等人，2022年；Phogat等人，2016年；Rastogi等人，2017年；Usman等人，2020年）。由于其微小的尺寸和高的表面积与体积比，纳米材料的性质（如反应性、毒性、细胞摄取性和生物利用性）可能与块状颗粒有显著差异（Rai等人，2018年；Rastogi等人，2017年；Sieg等人，2024年；Wojcieszek等人，2023年）。尽管纳米材料具有广泛的应用潜力，并被释放到环境中，但关于它们与生物系统相互作用的研究仍然不足（Capaldi Arruda等人，2015年；Phogat等人，2016年）。

化肥和农药在农业中广泛使用，以改善土壤质量和提高作物产量。然而，它们的使用会导致生态系统负面变化，如水污染和土壤退化（Kaningini等人，2022年）。解决这些问题的一个可能方法是使用纳米材料作为化肥或农药（Kaningini等人，2022年；Phogat等人，2016年；Usman等人，2020年）。纳米材料可用作营养物质和载体（Kaningini等人，2022年；Usman等人，2020年）。由于纳米材料体积小且表面积与体积比大，它们能够穿越细胞屏障，并与生物分子发生更强烈的反应（Phogat等人，2016年；Rastogi等人，2017年；Usman等人，2020年）。这使得纳米肥料能更有效地被植物吸收，从而减少其损失，从而降低局部环境污染（Rai等人，2018年；Usman等人，2020年）。

另一方面，人们担心纳米材料可能对动植物产生负面影响。纳米材料可能在植物中积累，而植物是食物链中的生产者。因此，纳米材料有可能进入人体并产生不良后果（Phogat等人，2016年；Rastogi等人，2017年；Usman等人，2020年）。此外，纳米材料容易受到环境条件的影响，在土壤、植物表面、植物内部以及胃肠道中会发生物理、化学或生物变化，例如聚集、溶解、氧化还原反应、与生物分子的相互作用以及涂层形成（Lv等人，2019年；Rastogi等人，2017年；Usman等人，2020年；Wojcieszek等人，2023年；Zhang等人，2020年；Zhou等人，2022年）。这些变化可能导致纳米材料的活性发生正面或负面的改变（Phogat等人，2016年）。

由于纳米材料对人类健康的潜在影响仍不明确，因此研究其在农业应用中的安全性至关重要（Capaldi Arruda等人，2015年；Ndaba等人，2022年；Phogat等人，2016年）。植物生长需要大量的铁，因为铁在多种生理和生物过程中起着重要作用，如氮代谢、呼吸作用或光合作用、叶绿体的结构与功能形成，以及参与叶绿素、植物激素和其他生物活性物质的合成（Szuplewska等人，2023年）。因此，铁是农业中使用铁纳米材料的主要原因（Kaningini等人，2022年；Wojcieszek等人，2023年）。一些研究表明，在多种植物栽培中使用氧化铁形式的纳米材料可以改善植物生长参数和干物质含量（Shankramma等人，2016年；Tawfik等人，2021年）。另一种形式的铁纳米颗粒是零价铁（nZVI），它具有多种重要的特性，使其成为一种有吸引力的生物肥料。nZVI具有较大的表面积与体积比和高表面反应性，对金属污染物（如铅、砷、铬等）具有很强的亲和力，有潜力修复受污染的土壤和地下水（Wojcieszek等人，2023年）。低剂量的nZVI作为种子处理剂可以促进发芽和早期植物生长（Guha等人，2022年），但高浓度可能具有毒性，因此最终效果取决于剂量（Li等人，2020年）。此外，nZVI可以通过“绿色”方法（植物提取物、生物质）生产，这降低了成本和残留物的毒性，有利于其作为生物肥料的推广（Eslami等人，2018年；Lin等人，2021年）。

尽管铁被认为对人类健康的危害较低，但一些研究指出基于铁的纳米材料可能对生物体产生不良影响。因此，需要进一步研究Fe NPs在人体内的命运（Lei等人，2018年；Lowry等人，2012年；Sieg等人，2024年；Wojcieszek等人，2023年）。

本研究模拟了可食用植物中积累的Fe(0) NPs在胃肠道中的消化过程。我们应用并优化了INFOGEST 2.0 体外静态消化模型。该模型由COST INFOGEST网络开发，目前被广泛用于研究不同类型食物在上消化道的命运（Brodkorb等人，2019年；Zhou等人，2023年）。考虑到纳米材料的特殊性，需要调整现有方案以模拟单个纳米颗粒的消化过程（Vital等人，2024年）。

人类消化系统中的物理化学过程可以通过体外和体内消化模型进行模拟（Brodkorb等人，2019年；Zhou等人，2023年）。动物模型可以模拟人体内的消化过程，但使用动物模型可能需要杀死动物或进行手术取样，有时其适用性受到质疑（Brodkorb等人，2019年；Li等人，2020年；Zhou等人，2023年）。体内动物或人体消化模型通常成本高昂、耗时且难以实施，且被认为不符合伦理（Brodkorb等人，2019年；Li等人，2020年；Zhou等人，2023年）。鉴于这些问题，已经有多种体外模型（静态、动态和半动态）被用于研究人体消化过程（Brodkorb等人，2019年；Zhou等人，2023年）。动态模型用于多种应用（Kong & Singh，2010年；Ménard等人，2014年；Minekus等人，1995年；Molly等人，1993年；Wickham等人，2009年）。这些模型可以模拟消化过程中的动态、酶促和化学变化，但存在一些局限性，包括设计复杂、成本较高且不易获取（Brodkorb等人，2019年）。

INFOGEST静态模型模拟了人体消化道的三个部分——口腔、胃和小肠的消化条件。这些条件是标准化的，研究人员可以比较不同实验的结果。每个消化阶段的食物与酶和电解质的比率以及pH值都是恒定的。虽然静态模型无法模拟消化动力学，但它们是最简单且应用最广泛的消化模型。其主要优点是简单性、良好的实验室间重复性和相对较低的成本。INFOGEST静态模型可用于测量消化产物通过胃肠道后的浓度，还有助于理解趋势和样本筛选。由于我们的研究不需要关注消化过程的动态变化，因此INFOGEST静态模型是合适的（Brodkorb等人，2019年；Zhou等人，2023年）。

纳米颗粒的表征可以采用多种技术，如高效液相色谱（HPLC）、非对称流场流分离（AF4）、扫描电子显微镜（SEM）、紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等。这些技术可分为三类：分离、显微镜观察和光谱分析。选择合适的技术取决于所研究纳米颗粒的特性、基质的组成、分析物的浓度以及样品的物理化学性质（Capaldi Arruda等人，2015年）。

电感耦合等离子体质谱能够实现纳米颗粒的定量和痕量分析，因为它具有高灵敏度。此外，专门针对纳米颗粒分析改进的ICP-MS技术——单颗粒电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）——除了定量外，还能确定纳米颗粒的大小和大小分布（Capaldi Arruda等人，2015年；Espada-Bernabé等人，2024年；Flores等人，2021年）。许多研究已经使用ICP-MS和SP-ICP-MS来表征纳米颗粒，并研究其生物利用性、生物累积性和与植物的相互作用（Bao等人，2016年；da Silva & Arruda，2023年；Espada-Bernabé等人，2024年；Freire等人，2024年；Kińska等人，2018年；Wang等人，2022年；Wojcieszek等人，2019年；Wojcieszek等人，2020年；Wojcieszek, Chay, Jiménez-Lamana, Curie和Mari，2023年）。

材料

除非另有说明，所有分析或生物试剂级化学品及LC-MS级溶剂均从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。本研究中使用的水为超纯水（18?MW?cm），由Milli-Q系统（法国Guyancourt）制备。用于痕量金属分析的硝酸（纯度≥69.0%）从Fluka（瑞士Buchs）购买。标准离子溶液（铁和金浓度为1000?mg?L^?1，溶于2% HNO₃）由Merc（德国达姆施塔特）提供。

水溶剂中Fe(0) NPs的稳定性研究

含金属的纳米颗粒是具有反应性的化合物，可能会溶解、聚集或与各种化学物质发生相互作用。因此，在进行植物栽培和分析之前，必须先研究这些纳米颗粒在水溶液中的稳定性。为了确定Fe(0) NPs是否会在水溶液中发生变化，我们将相同质量的Fe(0) NPs分散在恒定体积的超纯水中并对其进行超声处理。

结论

本研究利用STEM成像技术、单颗粒ICP-MS/MS以及总铁含量测定方法，研究了零价铁纳米颗粒（Fe(0) NPs在模拟的口腔-胃-肠道消化过程中的稳定性、物理化学特性和转化行为。系统地研究了消化酶浓度对Fe(0) NPs行为的影响，并优化了含有金属纳米颗粒的植物材料的酶用量。所有实验步骤均按照标准操作。

CRediT作者贡献声明

朱莉塔·诺沃萨德科（Julita Nowosadko）：数据分析、数据整理。苏珊娜·希曼斯卡（Zuzanna Szymańska）：实验研究、数据分析、数据整理。莫妮卡·库皮茨（Monika Kupiec）：初稿撰写、实验研究、数据分析、数据整理。莫妮卡·阿什特姆博尔斯卡（Monika Asztemborska）：实验研究。莉娜·鲁齐克（Lena Ruzik）：文章撰写与编辑、验证、实验监督、方法学设计、资金争取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了华沙工业大学“卓越计划：研究型大学（IDUB）”项目的资助。STEM相关实验使用了华沙工业大学先进材料与技术中心（CEZAMAT）提供的Hitachi SU 8230超高分辨率扫描透射电子显微镜。