《Food Research International》：Multi-scale investigation into the flaxseed oil emulsions stabilized by soybean protein isolate - (?)-epigallocatechin gallate covalent complexes: An “interface thickening – Structure unfolding – Antioxidant reinforcement” cascade mechanism
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植物蛋白-多酚共价复合物通过多尺度协同机制提升亚麻籽油乳液稳定性：量子化学计算揭示共价键形成（C-S和C=N键）窄化能带隙增强抗氧化能力；分子动力学模拟证实多酚促使蛋白β-折叠向无规卷曲转变，降低表面疏水性；介观尺度DPD模拟显示界面增厚与油水分布均匀化；宏观评估显示复合物比例（SPI:EGCG=20:1）时乳液物理和氧化稳定性最佳。
Kangning Li|Qidong Xue|Abdelaziz Elbarbary|Yuxuan Wang|Minjie Cao|Le Yu|Sri Raharjo|Ming Chang|Ruijie Liu
江南大学食品科学与技术学院食品科学与技术国家重点实验室，中国江苏省无锡市滨湖区梨湖路1800号，邮编214122
摘要
植物蛋白稳定的乳液在储存过程中面临物理稳定性和氧化稳定性的挑战，这极大地限制了这些乳液的进一步应用。本研究建立了一种多尺度机制，利用大豆蛋白分离物（SPI）与（?）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的共价复合物来提高亚麻籽油乳液的稳定性。通过改变碱性pH值制备的不同SPI:EGCG质量比（200:1至20:1）的复合物，显示出剂量依赖性的乳液物理稳定性和氧化稳定性改善。宏观尺度评估（通过滴粒大小、ζ电位和脂质氧化测量）表明，较高的EGCG掺入量可以减小滴粒大小、增加ζ电位幅度并抑制脂质氧化。介观尺度的耗散粒子动力学模拟显示EGCG介导了界面增厚和油水分布的均匀性。分子分析证实了EGCG的
o-醌形式与SPI中的Lys/Cys残基之间的共价C
S硫醇-醌和C
N席夫碱连接，导致SPI从β-折叠结构转变为无序卷曲结构，并降低了表面疏水性。量子化学计算显示，共价结合的EGCG的HOMO-LUMO能隙变窄，增强了界面抗氧化能力。这种稳定机制遵循“界面增厚——结构展开——抗氧化增强”的跨尺度过程。本研究为设计蛋白质-多酚复合物及其在生物活性递送和利用这些复合物稳定的乳液开发多种产品提供了机制上的见解。
引言
油包水乳液是不相溶液体的胶体分散体，广泛应用于食品、制药、化妆品和化学工业（Lee和Choo，2015年）。通常，它们由水作为连续相，油作为分散相，乳化剂吸附在界面以降低界面张力并稳定系统（Hashemi、Assadpour、Wang和Jafari，2025年）。乳化剂包括小分子剂如卵磷脂、合成表面活性剂如Tween和Span、合成聚合物（Wong、Lim和Dol，2015年）以及生物聚合物表面活性剂如蛋白质和多糖（Marhamati、Ranjbar和Rezaie，2021年）。然而，由于清洁标签要求、安全问题、潜在毒性和环境影响，合成表面活性剂在许多行业，特别是在食品应用中受到越来越多的限制。这促使人们关注生物聚合物表面活性剂，特别是蛋白质，因为它们具有高表面活性、生物降解性和生物相容性（Ho、Razzaghi、Ramachandran和Mikkonen，2022年）。具体来说，由于植物蛋白的天然丰富性、成本效益以及符合植物基健康趋势和素食饮食，研究人员和消费者更倾向于使用植物蛋白（Gonzalez Ortiz等人，2020年）。因此，由植物蛋白稳定的乳液已成为研究和食品工业的焦点，对于递送生物活性化合物、强化食品产品以及开发满足日益增长的健康和营养需求的特殊医疗和功能性食品至关重要。
然而，由于植物蛋白对光、热、pH值和氧气等环境因素的敏感性，由植物蛋白稳定的乳液在加工、运输和储存过程中表现出较差的物理稳定性和氧化稳定性，这极大地限制了这些乳液的进一步应用（Ghelichi等人，2023年）。为了解决这个问题，研究人员尝试修改植物蛋白的结构，特别关注通过共价或非共价结合形成的植物蛋白-多酚复合物（Can Karaca、Tan、Assadpour和Jafari，2025年）。在植物蛋白-多酚非共价复合物中，多酚和蛋白质之间的非共价相互作用（氢键、疏水力、范德华力）可以改变蛋白质的构象和功能（You、Yang、Chen、Xiong和Yang，2021年）。然而，这些弱相互作用导致蛋白质-多酚结合不牢固。因此，研究人员开发了植物蛋白-多酚共价复合物。植物蛋白-多酚共价复合物中的共价结合涉及蛋白质和多酚之间更强的共价键（Huang、Lee、Wang和Qiu，2023年）。这种共价连接结合额外的非共价相互作用，使得蛋白质和多酚之间的结合比单独的非共价相互作用更为紧密（Dai等人，2023年）。此外，共价结合诱导了植物蛋白更明显的构象和功能变化。植物蛋白和多酚之间的非共价和共价相互作用都可以改变蛋白质的空间结构，从而增强其乳化稳定性，并积极影响由改性植物蛋白稳定的乳液的物理稳定性（Li、Al-Wraikat、Hao和Liu，2024年）。在这些乳液系统中，植物蛋白和多酚之间的相互作用使多酚能够锚定在蛋白质上，从而在油水界面增强多酚的吸附，更有效地抑制界面自由基的形成。这种抑制可能减弱油相内的自由基链反应，从而提高乳液的氧化稳定性（Pei等人，2019年）。
最近的研究广泛探讨了植物蛋白和多酚之间共价复合物的性质、功能、应用和制备方法（Girard和Awika，2020年），并且文献中也报道了由这些复合物稳定的乳液系统（Chen、Li等人，2024年；Chen、Wang和Xiao，2024年；Chen、Zhang等人，2024年）。然而，仅靠实验研究可能不足以完全阐明这些复合物的具体相互作用机制和结构-功能关系，因为植物蛋白和多酚的多样性和结构复杂性。这一限制阻碍了对这些乳液稳定机制的深入理解。为了解决这一挑战，研究人员采用了计算模拟，包括分子对接和分子动力学模拟，来研究植物蛋白和多酚之间的相互作用（Tang等人，2024年）。这些模拟提供了关于多酚如何影响蛋白质结构并增强乳液稳定性的见解。然而，大多数对接模拟是灵活的或半灵活的，并没有涉及新共价键的形成，这仍然限制了蛋白质-多酚共价复合物的结构-功能关系和相互作用机制的研究（Liu、Liang、Jiang、Ma和Jia，2024年）。此外，从分子模拟推断宏观乳液性质仍然具有挑战性，因为乳液稳定性主要是介观尺度现象。因此，需要采用多尺度方法来全面研究乳液中蛋白质-多酚复合物的相互作用、稳定机制和结构-功能关系，从而促进植物蛋白-多酚共价复合物的制备及其在乳液中的广泛应用。
因此，选择大豆蛋白分离物（SPI）作为食品工业中广泛使用的植物蛋白。（?）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为模型多酚，因为它们是天然且具有生物活性的化合物。此外，选择亚麻籽油作为油相，以便研究乳液的氧化稳定性，因为它富含α-亚麻酸且容易氧化。在本研究中，制备了不同SPI与EGCG质量比的SPI-EGCG共价复合物，并用它们来稳定亚麻籽油乳液。通过结合实验和计算方法的多尺度方法（包括量子、分子、介观和宏观尺度），系统地研究了界面组成和性质、相互作用机制以及界面组成的结构-功能关系。这项综合分析旨在揭示增强植物蛋白-多酚共价复合物稳定的乳液稳定性的潜在协同机制，为界面工程、生物活性递送和各种产品的开发提供有价值的理论见解。
材料
SPI（Bio Ultra级）和EGCG（Bio Ultra级）购自上海Titan Scientific有限公司。亚麻籽油（Longya No. 10）使用螺旋压榨机（ZYJ-420，东莞方泰电气有限公司，中国）在实验室中提取。亚麻籽油的组成信息见表S1。1,1-二苯基-2-吡啶肼（DPPH）和2,2-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）购自 Yuanye Biotechnology有限公司（上海，中国）。其他所有
SPI-EGCG复合物对乳液稳定性的宏观尺度评估
如图1a所示，制备了由SPI或SPI-EGCG共价复合物稳定的亚麻籽油乳液。新鲜制备的乳液（第0天）显示在图1b中。所有乳液样品在储存过程中的外观变化表明，Control-E和C200-E出现了明显的乳化分层和分层现象，表明其动力学稳定性较差。相比之下，用逐渐增加EGCG负载量合成的复合物（C100-E、C50-E和C20-E）制备的乳液
结论
共价EGCG结合在量子、分子、介观和宏观尺度上触发了SPI的同步重构，共同增强了亚麻籽油乳液的物理稳定性和氧化稳定性。在分子水平上，EGCG在pH 9.0时被氧化为
o-醌形式，并与SPI中的自由硫醇和胺反应，形成C
S硫醇-醌和C
N席夫碱键。这些连接使SPI的二级结构从β-折叠转变为无序卷曲，改变了表面
CRediT作者贡献声明
Kangning Li：撰写——原始草稿，可视化，数据管理。Qidong Xue：可视化，数据管理。Abdelaziz Elbarbary：撰写——审阅与编辑，形式分析。Yuxuan Wang：数据管理。Minjie Cao：撰写——审阅与编辑，形式分析。Le Yu：撰写——审阅与编辑。Sri Raharjo：撰写——审阅与编辑。Ming Chang：撰写——审阅与编辑，调查，形式分析。Ruijie Liu：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金支持
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了“国家自然科学基金”（编号：32372333）和“江苏省国际科技合作计划”（编号：BZ2024022）的支持。
