《International Journal of Biological Macromolecules》：Preparation of sulfur-containing protein-based ammonium phosphate flame retardants to achieve durable flame-retardant properties in cotton fabric
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鸭瘟病毒快速检测技术基于CRISPR/Cas12a与RPA联用，建立荧光定量和胶体金试纸双模式检测系统，灵敏度达7.8 copies/μL，较传统PCR提升1000倍，特异性验证无交叉反应。
肖一萌|杨静静|杨文|袁梅|张云翔|刘继英|张玉娟|朱焕曦|罗刚
江苏省科技大学生物技术学院家禽与动物生物技术重点实验室，镇江，212100，中国
摘要
鹅细小病毒（GPV）是一种高致病性和致命性的病毒，会导致雏鹅和鸭子患上德氏病（Derzsy’s disease），严重影响水禽养殖的经济效益。因此，迫切需要开发快速诊断技术以有效控制该疾病。本研究开发了一种优化的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法来诊断GPV。实验确定了CRISPR/Cas12a荧光检测的最佳条件为20 nM AsCas12a、5 nM crRNA和5 nM单链DNA（ssDNA）；而侧向流动分析（LFA）则需要20 nM AsCas12a和4 nM crRNA。这两种方法的最低检测限分别为7.8拷贝/μL和78拷贝/μL，相比传统的PCR方法提高了1000倍和100倍。这两种检测方法均表现出高特异性，并且没有与其他常见的水禽病原体（如鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、H5禽流感病毒、水禽星状病毒、呼肠孤病毒、麝香鸭细小病毒和新发现的GPV株）发生交叉反应。LFA的结果与实验室qPCR分析完全一致，证明了其在临床诊断中的可靠性。总之，我们成功开发了一种利用CRISPR/Cas12a技术的双读数GPV检测系统，对于早期监测和控制GPV疫情具有重大意义。
引言
鹅细小病毒（GPV）感染，也称为德氏病，是一种主要影响雏鹅和鸭子的传染性病毒疾病。该病的症状包括嗜睡、严重的水样腹泻、生长迟缓、羽毛脱落和肠道栓塞，五天以下的雏鹅死亡率超过95% [1]。该疾病已在中国、欧洲和美国被记录到，对水禽养殖构成了严重威胁 [2]。近年来，一种新的GPV株的出现进一步复杂化了疾病管理。这种变异株会导致樱桃谷鸭和麝香鸭的生长受阻，加剧了控制GPV疫情的难度 [3]、[4]。鉴于GPV造成的经济损失和高死亡率，开发准确、快速和高效的诊断方法对于实施有效的预防和控制策略至关重要。
GPV感染的诊断与其他病毒性疾病类似，通常首先通过评估临床症状和流行病学调查开始，然后通过血清学或分子方法（如聚合酶链反应（PCR）进行实验室确认 [5]。常用的血清学技术包括琼脂凝胶免疫扩散、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验；然而，这些方法的应用往往受到操作复杂性和专业人才需求的限制 [6]、[7]。分子方法（如PCR）具有更高的特异性和敏感性。例如，Wan等人 [8] 开发了一种针对NS基因的PCR检测方法，能够检测到低至10^3拷贝的GPV。同样，Lin等人 [9] 设计了一种基于SYBR Green的定量PCR（qPCR）方法，可检测到10^1拷贝的GPV。尽管这些方法精度较高，但传统的PCR和qPCR都需要昂贵的热循环设备和专业技术知识，这限制了它们在现场诊断中的实用性，尤其是在资源有限的环境中。
COVID-19的爆发加速了快速、便携式诊断技术的发展，如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification），这些技术对于疫情预防和控制至关重要。与传统PCR方法相比，这些等温扩增技术具有反应时间短、设备要求低和更适合现场应用等优点。例如，RPA可以在37°C的恒定温度下在30分钟内扩增目标核酸，从而简化程序并显著缩短检测时间 [10]。当与逆转录酶结合使用时，RPA可以快速检测RNA病毒（如拉克罗斯病毒），cDNA扩增可在20分钟内完成 [11]。此外，RPA与SYBR Green染料的结合使得能够在25分钟内准确检测牛病毒性腹泻病毒，同时具有更高的速度和特异性，且不会与其他腹泻病原体发生交叉反应 [12]。此外，RPA与CRISPR/Cas12a技术的结合推动了便携式、可视化、现场诊断工具的发展 [13]、[14]。一个典型的例子是一种基于荧光的即时检测（POC）系统，能够在2小时内高通量检测非洲猪瘟病毒（ASFV）[15]，展示了RPA-CRISPR/Cas12a系统在快速现场诊断方面的潜力。
在本研究中，我们开发了一种利用RPA结合CRISPR和Acidaminococcus sp. CRISPR-associated nuclease 12a（AsCas12a）的快速高灵敏度GPV检测方法。与现有的RPA-CRISPR平台相比，我们的研究在两个方面进行了创新：首先，我们开发了一种基于侧向流动分析的新方法，其灵敏度比传统PCR提高了100倍，便于快速可靠的现场GPV诊断；其次，我们建立了一种高灵敏度的荧光检测系统，使用较低浓度的AsCas12a，检测限达到7.8拷贝/μL。该系统的灵敏度与Chen等人之前报道的GPV-CRISPR/Cas12a系统相当，同时检测成本降低了约5倍。表S1详细比较了我们的方法与Chen等人的方法，在检测反应浓度、灵敏度、特异性和成本方面进行了说明。这些改进显著提高了GPV检测方法的灵敏度和现场适用性。
材料与方法
菌株、质粒和试剂
用于质粒构建的试剂包括pET-28b-T7-henAsCas12a-HF1-NLS-6 × His（Addgene#114073）、E. coli BL21（DH3）感受态细胞（TOLOBIO，上海，中国）和pMD?19-T载体克隆试剂盒（Takara，大连，中国）。此外还使用了BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）、RIPA裂解缓冲液（Beyotime，上海，中国）、苯甲磺酰氟（PMSF，Beyotime，上海，中国）和异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷（Macklin，上海，中国）、Super ECL检测试剂（Yeasen，上海，中国）。RPA-CRISPR/AsCas12a检测技术的工作流程
RPA-CRISPR/AsCas12a系统是一个集成的诊断平台，结合了RPA和基于CRISPR/Cas12a的检测方法，以实现快速的核酸分析。该诊断平台通过以下两个步骤进行：(i) 在37°C下进行RPA介导的等温扩增；(ii) 在识别目标序列后激活AsCas12a的切割活性。讨论
由于成本效益和已建立的可靠性，传统的PCR仍然是实验室环境中广泛使用的GPV检测方法。先前的研究（包括我们的实验数据）表明，传统PCR的检测限为10^3拷贝/μL [8]、[17]（见表S1）。然而，这种灵敏度限制了PCR在早期GPV感染样本中的诊断应用。
为了提高GPV检测的灵敏度，我们采用了多种改进措施。
CRediT作者贡献声明
肖一萌：撰写初稿、项目管理、方法学设计、数据整理。杨静静：监督、项目管理、数据整理。杨文：项目管理、数据整理。袁梅：数据可视化、项目管理。张云翔：项目管理。刘继英：撰写、审稿与编辑、数据整理、概念构思。张玉娟：撰写、审稿与编辑、数据整理。朱焕曦：撰写、审稿与编辑、方法学设计、资金支持机构审查委员会声明
本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。资助
本项工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32102542）、江苏省农业科技创新基金（项目编号：CX(24)1012）、国家重点动物生物技术育种实验室开放项目（项目编号：2025SKLAB6-17）以及江苏省产学研合作项目（项目编号：BY20240298）的支持。利益冲突声明
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