多站点Crelox重组技术有助于阐明调控机制，并实现对Aspergillus nidulans中棘孢菌素B生物合成的系统工程改造

《Metabolic Engineering》：Multisite Cre- lox Recombination Enables Regulatory Mechanism Elucidation and Systematic Engineering of Echinocandin B Biosynthesis in Aspergillus nidulans

真菌合成生物学、正交Cre-lox系统、代谢工程优化、echinocandin B产量提升、多基因协同调控

　　

Youchu Ma|Yue Zhang|Dongfang Zhang|Yue Tang|Wanyu Zhang|Liyuan Yue|Wenqing Lou|Chao Meng|Yanling Li|Xiulai Chen|Fanglong Zhao

山东第一医科大学与山东医学科学院生命科学学院，中国山东省泰安市，271016

摘要

棘球素B（ECB）是一种用于合成抗真菌药物的环状脂六肽，由Aspergillus nidulans中的非核糖体肽合成酶基因簇产生。然而，其工业生产仍受到生产效率低下的限制，主要是由于生物合成途径的复杂性以及丝状真菌中缺乏多基因调控工具。在此，我们建立了一个基于Cre-lox的正交平台，能够在A. nidulans中实现最多30 kb的单点插入和10 kb DNA片段的同步双点整合。通过前体补充和目标基因过表达，我们确定了前体生物合成途径中的关键酶学瓶颈，包括氧合酶AniF、 AniK、AniG以及酰基-AMP连接酶AniI。这些基因的组合过表达协同作用提高了ECB的产量。此外，我们还通过过表达对反馈具有抗性的Hom3（L-苏氨酸途径）和LeuC（L-亮氨酸途径）突变体来解决天然氨基酸生物合成中的瓶颈问题。利用我们的多基因整合平台重新调控这些关键基因的表达，我们在5-L发酵罐中将ECB的产量提高了3.5 ± 0.2 g/L，这一改进幅度是迄今为止文献中报道的最高水平。我们的正交双点整合策略和系统优化方法为丝状真菌中复杂天然产物的代谢工程提供了有价值的框架。

引言

真菌感染是全球主要的公共卫生问题，每年影响超过十亿人（Fisher等人，2022年）。棘球素类化合物（包括卡泊芬净（Cancidas?，默克公司）、米卡芬净（Mycamine?，安斯泰来公司）、阿尼杜拉芬净（Eraxis?，辉瑞公司）和雷扎芬净（Rezzayo?，Cidara Therapeutics公司）是侵袭性念珠菌病和曲霉病的一线治疗药物（Albanell-Fernández，2025年）。这些脂六肽作为非竞争性抑制剂，能够抑制真菌的1,3-β-葡聚糖合成酶，从而破坏真菌细胞壁的生物合成（Hu等人，2023年）。作为该类药物的最新成员，雷扎芬净具有更好的化学稳定性和水溶性，半衰期延长至约一周，简化了储存和给药方案（Garcia-Effron，2020年）。

棘球素B（ECB）由真菌的非核糖体肽合成酶（NRPS）生产，是阿尼杜拉芬净和雷扎芬净的关键前体（图1A）。阿尼杜拉芬净是一种半合成脂肽，通过用合成三苯基基团替换其天然的亚油酸链获得；而雷扎芬净则通过在鸟氨酸残基的C5位引入胆碱醚结构来进一步提高溶解性和稳定性（Szymański等人，2022年）。因此，高效的ECB生产对于这些抗真菌药物的制造至关重要。然而，现有的发酵工艺产量低且产量不稳定，限制了其大规模和低成本的生产（Emri等人，2013年；Hüttel，2021年；Jiang等人，2024年；Niu等人，2021年；Niu等人，2025年；Szymański等人，2022年；Tian等人，2024年）。

合成生物学方法有助于阐明生物合成过程并优化代谢途径，从而提高产量。在Aspergillus nidulans NRRL8112中，已经鉴定并表征了ECB的生物合成基因簇（ani BGC）；该基因簇编码13个基因，参与非蛋白质氨基酸前体的合成、NRPS的组装以及六肽的修饰。该途径可以分为三个功能模块（图1C）（Cacho等人，2012年；Hüttel，2016年；Jiang等人，2013年；Jiang等人，2025年）：（1）NRPS组装模块，其中AniA（NRPS）和AniI（脂肪酰基AMP连接酶）利用活化的亚油酸、L-鸟氨酸、两个L-苏氨酸单元以及三种非典型氨基酸（4R-羟基-L-脯氨酸（OH-Pro）、3S-羟基-L-同型酪氨酸（OH-hTyr）和4S-甲基-3S-羟基-L-脯氨酸（OH-MePro）组装六肽核心；（2）前体合成模块，生成非蛋白质氨基酸：OH-Pro通过铁依赖性氧化酶AniF催化的羟基化反应生成；OH-hTyr通过AniB到AniF的多酶级联反应生成，该级联反应将初级代谢中间体4-羟基苯丙酸（4-HPPA）依次转化为L-同型酪氨酸（hTyr），随后在C3位进行羟基化；同时，OH-MePro通过AniK和AniF的协同作用生成，这两种酶分别催化L-亮氨酸的氧化和羟基化；（3）六肽修饰模块，其中P450单加氧酶AniH和AniF₂分别催化循环肽中L-Orn残基的C4/C5位和hTyr残基的C4位的羟基化。

复杂的ECB生物合成途径受多种因素共同影响，这些因素共同决定了生产效率。六种前体底物的可用性、NRPS组装的催化效率以及修饰酶的活性都直接影响最终产量。发酵研究表明，补充某些氨基酸前体可以显著提高ECB的产量（Hu等人，2016年；Niu等人，2020年；Niu等人，2023年），表明前体供应是一个关键瓶颈。环境参数（如温度、离子强度和渗透压）也会影响ECB的产量（Cockshott等人，2001年；Hu等人，2016年；Hu等人，2020年；Niu等人，2020年；Niu等人，2023年；Zou等人，2015年），其中温度具有显著影响。先前的研究表明，高温（30-37 °C）会显著下调ECB基因簇的表达（Jiang等人，2025年），通常建议在25 °C下进行培养。高温下是否会出现其他代谢限制尚不清楚。近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术的发展促进了ECB代谢调控机制的研究。特别是，发现了几种全局调控因子（LaeA、VeA和VelB）（Lan等人，2020年）和途径特异性调控因子（AniJ/EcdJ）（Jiang等人，2025年；Tian等人，2024年），为合理工程提供了新的靶点。然而，天然转录因子对生物合成基因的不同激活方式往往会导致代谢通量的不平衡。这些限制凸显了系统化途径工程的需求。

工程化复杂的生物合成途径通常需要大规模的基因组重组，这需要大规模的基因组整合策略（Dong和Chen，2025年；Ko等人，2020年；Shi等人，2016年）。由于多种因素影响ECB的生物合成，同时进行多基因位点的基因组整合将大大有助于揭示它们对生产效率的协同效应。然而，在丝状真菌中实施此类方法仍然具有挑战性，因为与Saccharomyces cerevisiae和Escherichia coli等模式生物相比，合成生物学工具箱还不够成熟（Li等人，2025年；Mózsik等人，2025年）。最近的研究表明，如Cre/LoxP和Flp/FRT这样的位点特异性重组系统可以实现高效的大DNA片段整合（Roux和Chooi，2022年；Sun等人，2025年；Yao等人，2025年）。LoxP有许多不同的突变体（例如Lox2272和Lox511）（Cautereels等人，2024年；Missirlis等人，2006年）；然而，尚未有关于在丝状真菌中使用正交Cre-lox进行多基因位点整合的报告。

在这里，我们基于正交Cre-lox重组系统，在一种产生ECB的菌株中开发了一个靶向的双基因位点整合平台。该遗传工具允许进行约30 kb的单点插入和10 kb DNA片段的同步双点整合，从而实现快速的组合基因组整合和复杂生物合成途径的优化。利用这一平台，我们系统地识别了非典型和天然氨基酸前体供应网络中的七个限速步骤。此外，我们发现了一个关键基因odeA，它参与亚油酸的合成，其温度依赖性调控模式与ani基因簇相同。温度变化会改变脂肪酸组成，从而影响ECB的产量。高效整合平台实现了组合多基因调控，通过系统化的代谢工程，使ECB的产量达到了3.5 ± 0.2 g/L，这是迄今为止报道的最高水平。

章节摘录

正交Cre-lox重组技术在A. nidulans中实现双基因位点基因组整合

为了实现生物合成途径的组合优化的一步多基因整合，我们最初开发了一个基于正交Cre/lox重组系统的双基因位点、大片段基因组整合平台（图2A）。亲本菌株为A. nidulans BGCm5，这是一种产生ECB的菌株，其多个副产物BGC已被失活（Tian等人，2025年）。该菌株经过多重碱基编辑，以失活非同源末端连接酶NkuA和

讨论

在这项研究中，我们开发了一个在A. nidulans中的多重基因组整合平台，利用正交Cre-lox重组系统实现大规模的双基因位点基因组插入。利用该系统，我们重建并优化了ECB的生物合成途径，ECB是一种临床上重要的抗真菌前体。系统化的途径重构使ECB的产量提高了3.5 ± 0.2 g/L，这是迄今为止报道的最高产量。我们的工作提供了一种稳健且稳定的工程方法

菌株、培养基和培养条件

Escherichia coli Trelief ? 5α化学感受态细胞（DLC101，Tsingke Biotech，北京，中国）被用作质粒制备的宿主，工程改造后的E. coli菌株在含有卡那霉素（100 mg/L）的LB培养基中于28-37 °C下培养，用于克隆和质粒扩增。Saccharomyces cerevisiae BY4741化学感受态细胞（CC301，Coolaber Biotech，北京，中国）被用作构建大型质粒的宿主，S. cerevisiae细胞在30 °C下培养

CRediT作者贡献声明

Wenqing Lou：可视化、方法学、研究。Liyuan Yue：可视化、方法学、研究。Yanling Li：写作——审稿与编辑、写作——初稿、监督、资源管理、研究、概念化。Chao Meng：监督、方法学、研究。Dongfang Zhang：写作——初稿、验证、资源管理、方法学、研究、数据管理。Yue Zhang：写作——初稿、验证、方法学、研究、数据管理，

未引用参考文献

Cockshott和Sullivan，2001年；Feng和Leonard，1998年；Hüttel等人，2016年；Ma等人，2025年；Mózsik等人，2021年；Rezazade和Dehghani，2022年；Shimizu和Katsuki，1975年。

遵守伦理要求

本文不包含任何涉及人类或动物的研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22578253）、山东泰山奖学金（编号tsqn202306269）、山东省自然科学基金（编号2024HWYQ-057；编号ZR2024QC029）以及教育部工业生物技术重点实验室的开放资助项目（编号KLIB-KF202403）的支持。