亲和力优化的TCR-T细胞靶向KRAS新抗原实现高效肿瘤清除及肿瘤微环境重塑

《Frontiers in Immunology》：Avidity-optimized TCR-T cells target KRAS neoantigens for potent cancer clearance and tumor microenvironment remodeling

本综述聚焦于针对KRAS G12V8–16-HLA-A*11:01新抗原的高亲和力T细胞受体（TCR）工程化改造。研究团队从天然TCR（TCR0）出发，通过噬菌体展示技术优化其互补决定区1α（CDR1α），获得了亲和力提升超过2万倍的TCR3突变体。TCR3-T细胞在体外及体内模型中均展现出对表达相应新抗原的结直肠癌、肺癌及胰腺癌细胞株的强大且特异性的杀伤活性，并能有效克服程序性死亡配体1（PD-L1）介导的免疫抑制、抵抗吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）代谢产物及转化生长因子β（TGF-β）的抑制作用，同时通过分泌特定趋化因子（如CXCL9, CXCL10, CCL2等）增强肿瘤浸润并招募树突状细胞等免疫细胞，重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME），为KRAS突变相关癌症的过继性细胞免疫治疗提供了具有高潜力的候选方案。

　　

引言

KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）是常见的致癌驱动基因，其突变与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。KRAS G12V是其中一种高频突变亚型。尽管KRAS新抗原被视为有潜力的免疫治疗靶点，但此前尚无靶向KRAS新抗原的免疫产品获批临床应用，其在疗效和普适性方面仍面临挑战。本研究旨在通过优化T细胞受体（TCR）的亲和力，开发能够有效靶向KRAS G12V_8–16-HLA-A*11:01新抗原的TCR-T细胞，以克服肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的免疫抑制，实现有效的肿瘤清除。

材料与方法

研究首先从健康供者外周血单核细胞（PBMCs）中分离出可特异性识别KRAS G12V_8–16-HLA-A*11:01复合物的天然TCR，命名为TCR0。随后，通过构建TCR0的CDR1α区突变噬菌体展示文库，筛选获得亲和力显著优化的TCR突变体——TCR3。利用慢病毒载体将TCR0和TCR3基因分别转导至人CD8⁺和CD4⁺T细胞，制备相应的TCR-T细胞。通过酶联免疫斑点（ELISPOT）、乳酸脱氢酶（LDH）释放、流式细胞术检测激活标志物（如CD137）和细胞内因子（如IFN-γ）、细胞增殖实验、Transwell迁移实验以及小鼠异种移植瘤模型等多种体外和体内实验，系统评估了TCR0-T细胞与TCR3-T细胞的功能差异。

结果

3.1 野生型TCR的分离与亲和力优化

分离得到的TCR0能特异性结合KRAS G12V_8–16-HLA-A*11:01四聚体，但对野生型肽段无反应。然而，TCR0-T细胞的功能亲合力较低，仅在较高肽浓度（>10^-7M）下才能有效激活和杀伤靶细胞。优化后的TCR3在CDR1α区含有五个氨基酸替换，其在T细胞表面的表达水平更高，且功能亲合力提升了23,537倍（EC₅₀为9.211 × 10^-12M），即使在极低肽浓度（10^-11M）下也能介导强烈的T细胞反应。

3.2 TCR3-T细胞在体外展现增强的抗原特异性细胞毒性

与TCR0-T细胞相比，TCR3-T细胞对表达KRAS G12V和HLA-A*11:01的肿瘤细胞系（如SW480-A1101, SHP-77-A1101, CFPAC-1-A1101）表现出显著增强的杀伤能力（通过LDH释放和活性Caspase-3检测）、T细胞活化（CD137表达）以及IFN-γ分泌。重要的是，TCR3-T细胞对不表达相应抗原的细胞（如HCC-366, SW620）无反应，显示了严格的特异性。此外，TCR3还能赋予CD4⁺T细胞杀伤肿瘤的能力，而TCR0则不能。

3.3 TCR3-T细胞在体内可清除肿瘤

在免疫缺陷（B-NDG）小鼠的异种移植瘤模型中，单次输注TCR3-T细胞能够完全抑制甚至清除SW480-A1101（结直肠癌）、SHP-77-A1101（肺癌）和CFPAC-1-A1101（胰腺癌）肿瘤的生长，其疗效显著优于TCR0-T细胞和未转导的T细胞对照组，且无需外源性白细胞介素-2（IL-2）支持。

3.4 TCR3-T细胞克服PD-L1介导的免疫抵抗

尽管高表达PD-L1的SW480-A1101-hPD-L1肿瘤细胞能部分抑制TCR0-T细胞的活化和杀伤功能，但TCR3-T细胞仍能保持强大的细胞毒性。在体内，TCR3-T细胞也能有效清除SW480-A1101-hPD-L1肿瘤。有趣的是，在与高表达PD-L1的靶细胞共培养时，TCR3-T细胞表面的PD-1表达水平反而较低，提示其激活信号强度可能部分抵消了PD-1/PD-L1轴的抑制信号。

3.5 TCR3-T细胞对IDO介导的免疫抑制具有抵抗力

当存在IDO代谢产物犬尿氨酸（kynurenine）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）的混合物（KHAA）时，TCR0-T细胞的增殖受到显著抑制。相比之下，TCR3-T细胞即使在高达400 μM的KHAA存在下，其增殖能力也未受显著影响，表现出对IDO通路介导的免疫抑制的强大抵抗力。

3.6 亲和力优化的TCR-T细胞增强了对TGF-β1的抵抗能力

转化生长因子β1（TGF-β1）能诱导TCR0-T细胞表达Foxp3并向调节性T细胞（Treg）分化，并抑制其增殖。而TCR3-T细胞在TGF-β1存在下，Foxp3的上调程度显著低于TCR0-T细胞，并且能更好地维持其增殖能力，表明高亲和力的TCR3能帮助T细胞抵抗TGF-β介导的免疫抑制。

3.7 TCR3-T细胞展现出增强的肿瘤浸润和免疫细胞招募能力

在Transwell共培养体系中，TCR3-T细胞能更有效地向表达抗原的SW480-A1101肿瘤细胞迁移，并显著招募更多的CD11c⁺树突状细胞/巨噬细胞。趋化因子检测发现，TCR3-T细胞在识别靶细胞后，能分泌高水平的CXCL8（IL-8）、CCL2（MCP-1）、CCL3（MIP-1α）、CCL4（MIP-1β）、CXCL9（MIG）和CXCL10（IP-10）等趋化因子，这可能是其增强免疫细胞招募和浸润的重要原因。

3.8 TCR3-T细胞显示严格的抗原特异性，无脱靶识别

TCR3-T细胞对13种不同类型的正常人原代细胞（如HUVEC, WI38-VA13等）均未产生显著的细胞毒性或激活反应（CD137表达）。丙氨酸扫描实验进一步证实，TCR3对KRAS G12V_8–16肽段的关键锚定残基（如V2, K9）及中央残基（如G3, A4, V5, G6, V7）具有严格的识别依赖性，确保了其靶向特异性。

讨论

本研究成功开发了一种针对KRAS G12V新抗原的高亲和力TCR（TCR3）。相较于野生型TCR0，TCR3介导的T细胞表现出显著增强的体外和体内抗肿瘤活性，并且能够克服肿瘤微环境中多种关键的免疫抑制机制，包括PD-L1、IDO代谢产物和TGF-β。此外，TCR3-T细胞还能通过分泌特定的趋化因子主动招募其他免疫细胞，重塑肿瘤微环境。其严格的特异性也降低了on-target off-tumor毒性的风险。这些特性使得TCR3成为治疗携带HLA-A*11:01和KRAS G12V突变癌症的一个极具前景的候选疗法。

结论

本研究为靶向致癌驱动基因突变治疗实体瘤提供了可行性方案：基于等位基因频率和HLA流行率选择新抗原表位，通过结构引导的亲和力优化在保持特异性的前提下增强TCR功能，并系统评估其对肿瘤微环境抑制因素的抵抗能力。由此获得的TCR3有望为解决KRAS突变癌症的临床疗效、安全性及免疫逃逸问题提供新的免疫治疗策略。