《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Exosome-related immune signatures and peripheral blood assays predict prognosis and immunotherapy response in hepatocellular carcinoma
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本综述系统阐述了肿瘤源性外泌体相关免疫（TDEI）基因在肝细胞癌（HCC）预后预测及免疫治疗耐药中的核心作用。研究通过构建基于S100A11和PUSL1的预后模型，并结合临床特征建立列线图，证实其能有效预测HCC患者生存。机制上，S100A11通过调控肿瘤微环境（TME）中癌症相关成纤维细胞（CAFs）与M2型巨噬细胞的相互作用，促进免疫抑制性TME形成，导致免疫治疗耐药。此外，研究发现外周血IL-6、CD8+T细胞及预后营养指数（PNI）可作为预测不可切除HCC患者免疫治疗反应的无创生物标志物，为HCC精准免疫治疗提供了新视角。
1 引言
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管早期HCC患者可从手术切除、肝移植和局部消融治疗中获益，但术后复发仍是影响生存的主要因素。对于晚期HCC患者，抗血管靶向药物联合免疫检查点抑制剂（ICIs）显著提高了疗效，但近30%的患者会产生继发性耐药，严重限制了其生存获益。因此，识别预后不良的高危患者及免疫治疗耐药人群是亟待解决的核心临床问题。
外泌体是直径为30-150纳米的生物活性脂质双层纳米囊泡，含有RNA、蛋白质等生物活性分子，可由几乎所有细胞分泌。肿瘤微环境（TME）是一个以异常血管生成、慢性炎症和细胞外基质重塑为特征的复杂结构混合物，其中存在多种免疫细胞并与之相互作用。在肝癌TME中，众多细胞促进肿瘤进展，来自肿瘤细胞和免疫细胞的外泌体通过运输蛋白质和RNA等物质参与细胞间通讯。肿瘤源性外泌体可直接被CD8+T细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和调节性T细胞等摄取，从而抑制其抗肿瘤功能或调节其细胞行为。免疫细胞也可分泌外泌体，例如M2巨噬细胞来源的miR-23a-3p和miR-27a-3p通过促进上皮-间质转化（EMT）、血管生成和HCC干性来促进肝癌进展。总之，外泌体通过在肿瘤细胞和免疫细胞之间传递信息而发挥不同作用。
基质细胞是TME的关键组成部分。成纤维细胞向癌症相关成纤维细胞（CAFs）的转化是TME改变导致免疫逃避的核心机制，而外泌体在此过程中起关键作用。肿瘤细胞来源的外泌体miR-1247-3p和RNPEP可通过促进成纤维细胞向CAFs转化，进而促进HCC的发展和远处转移。CAFs通过外泌体和细胞因子与免疫细胞和肿瘤细胞相互作用，这是改变TME的关键途径。CAFs来源的外泌体circZFR通过诱导M2巨噬细胞极化和增强癌症干性，促进HCC进展和化疗耐药。在胰腺癌中，CAFs来源的外泌体NOD1通过调节巨噬细胞向M2极化促进胰腺癌发展。CAFs分泌的CXCL9、CXCL10和白细胞介素-6（IL-6）通过抑制CD8+T细胞浸润和促进肝癌细胞增殖来推动HCC进展。在膀胱癌中，CAFs分泌的CXCL12通过促进肿瘤细胞PD-L1表达导致免疫耐药。外泌体通过介导肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的通讯，重塑TME，从而在肿瘤发生发展、免疫逃避和免疫治疗耐药中发挥多样化作用。
本研究旨在构建一个预测HCC患者预后和免疫治疗疗效的模型，并探讨肿瘤源性外泌体相关免疫（TDEI）基因在HCC进展和免疫治疗耐药发展过程中调节TME的作用。
2 材料与方法
研究数据来源于exoRBase2.0、GEO数据库GSE181946、癌症基因组图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（ICGC）数据库。通过差异表达分析筛选TDEI基因，并利用Cox回归和最小绝对收缩和选择算子（Lasso）回归分析鉴定与HCC患者总生存期（OS）密切相关的TDEI基因，进而构建风险预后模型。通过免疫浸润分析（TIMER、CIBERSORT、EPIC算法）评估TME中免疫细胞和基质细胞的变化。利用免疫组织化学（IHC）、Western blot和实时定量PCR（qRT-PCR）验证TDEI基因对TME的调控作用。此外，回顾性收集接受ICIs治疗的不可切除HCC患者临床资料及外周血指标（如CD8+T细胞、IL-6、预后营养指数PNI等），以预测免疫治疗反应。
3 结果
3.1 TDEI基因的筛选
通过分析TCGA-LIHC中HCC肿瘤组织与正常组织的差异表达基因、exoRBase2.0中HCC患者与健康人群的外泌体相关基因、以及GSE181946中免疫治疗无反应组（PD）与反应组（PR）的差异表达基因，取交集后最终确定了20个TDEI基因。
3.2 突变与拷贝数变异分析
对20个TDEI基因在TCGA-LIHC中的体细胞突变谱进行分析，发现错义突变是最常见的突变类型。拷贝数变异（CNV）分析显示，19个TDEI基因存在CNV。
3.3 风险预后模型的构建与验证
通过单变量Cox回归和Lasso回归分析，最终确定S100A11和PUSL1两个基因与HCC患者OS显著相关。基于此构建的风险评分模型公式为：风险评分 = 0.00026 × S100A11表达量 + 0.02752 × PUSL1表达量。根据中位风险评分将患者分为高危组和低危组，Kaplan-Meier生存分析显示高危组OS率显著低于低危组。时间依赖性受试者操作特征（ROC）曲线表明该模型在TCGA和ICGC（LIRI-JP）队列中均具有良好的预测性能。
3.4 预后TDEI基因与临床特征的相关性
S100A11和PUSL1的高表达与较差的OS显著相关。此外，S100A11和PUSL1的高表达与较差的HCC组织学分级、较高的甲胎蛋白（AFP）水平（>400 U/mL）、东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态评分（≥2）以及微血管侵犯（MVI）显著相关。
3.5 预测模型列线图的构建
将风险评分与年龄、肿瘤分期、ECOG评分、Child-Pugh分级等临床病理特征结合，构建了预测HCC患者1、2、3、5年OS率的列线图。ROC曲线、校准曲线和临床决策曲线分析均证实该列线图具有良好的预测准确性、校准度和临床实用性。
3.6 免疫细胞浸润分析
ESTIMATE算法分析显示，S100A11高表达组的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分均高于低表达组，提示其具有免疫“热”表型。然而，TIDE评分预测S100A11高表达组对免疫治疗的反应较差。EPIC算法分析表明，在S100A11高表达组中，巨噬细胞和CAFs是TME中最丰富的两种细胞类型。S100A11表达与CAFs标志物成纤维细胞活化蛋白（FAP）表达呈正相关。进一步分析发现，在高浸润CAFs组中，免疫抑制性细胞如调节性T细胞（Tregs）和M2巨噬细胞浸润显著增加，而细胞毒性细胞如NK细胞和单核细胞浸润减少。M2巨噬细胞是其中最丰富的免疫细胞，表明CAFs与M2巨噬细胞的高浸润相关。
3.7 通路富集分析
对高浸润和低浸润CAFs组之间的差异表达基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，结果显示高浸润CAFs组与免疫细胞迁移、细胞因子活性、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路和TGF-β信号通路等显著相关。基因集富集分析（GSEA）进一步证实，高浸润CAFs组富集于细胞因子活性等免疫相关功能。
3.8 S100A11表达及调控TME的实验证据
IHC、Western blot和qRT-PCR结果一致表明，S100A11、FAP（CAFs标志物）和CD206（M2巨噬细胞标志物）在HCC肿瘤组织中的表达均显著高于癌旁正常组织。生存分析显示，S100A11和FAP高表达组患者的无进展生存期（PFS）显著短于低表达组。相关性分析证实S100A11表达与FAP表达呈正相关，且S100A11和FAP高表达组中CD206+M2巨噬细胞计数均显著升高。此外，早期复发（<2年）的HCC患者其肿瘤组织中FAP表达水平高于晚期复发（≥2年）者。
3.9 IL-6和外周血CD8+T细胞预测不可切除HCC免疫治疗反应
对64例接受ICIs治疗的不可切除HCC患者进行分析，根据初始疗效分为免疫无反应组（PD，n=27）和免疫反应组（PR/SD，n=37）。两组患者在年龄、性别、病毒性肝炎、基线AFP、PIVKA-II水平、Child-Pugh分级和BCLC分期等方面无显著差异。然而，免疫无反应组的外周血IL-6水平显著高于反应组，而外周血CD8+T细胞计数和PNI则显著低于反应组。ROC曲线分析显示，IL-6、外周血CD8+T细胞计数和PNI预测免疫治疗疗效的曲线下面积（AUC）分别为0.711、0.713和0.725，表明三者具有良好的预测价值。当IL-6 > 48.56 pg/mL、外周血CD8+T细胞计数 < 0.35 × 109/L、PNI < 40.08时，提示免疫治疗效果可能较差。
4 讨论
外泌体及其衍生的生物分子因其在多种癌症发生发展中的潜在作用，以及作为诊断生物标志物和治疗靶点的潜力而受到广泛关注。本研究通过Cox回归和Lasso回归分析，构建了一个整合了两个预后TDEI基因（S100A11和PUSL1）的预后特征，并结合临床特征建立了预测HCC预后和免疫治疗疗效的模型。当风险评分单独用于预测HCC患者预后时，其预测效能中等；但当与年龄、分期等临床病理特征结合时，预测模型的效能显著提高。
S100A11作为S100钙结合蛋白家族成员，在炎症、自身免疫性疾病和肿瘤发生中发挥重要作用。在HCC中，S100A11可通过AKT和ERK信号通路调控肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。本研究通过免疫浸润分析和通路富集分析，揭示了S100A11调控TME的可能机制：S100A11高表达可增加基质评分和CAFs浸润，而CAFs浸润增加又会促进M2巨噬细胞浸润。CAFs是TME中关键的促肿瘤成分，可通过分泌细胞因子诱导N2中性粒细胞、M2巨噬细胞等免疫抑制细胞的分化和聚集，或通过抑制T细胞、NK细胞等细胞毒性细胞发挥免疫抑制功能。GO和KEGG分析表明，高浸润CAFs与趋化作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TGF-β信号通路等相关。这提示外泌体S100A11被成纤维细胞摄取后，可能通过TGF-β信号通路促进其向CAFs转化，活化的CAFs进而通过分泌细胞因子（如IL-6）促进巨噬细胞向M2表型极化，M2巨噬细胞则通过表达免疫抑制分子（如CTLA-4、TIM-3/HAVCR2）导致免疫抑制性TME形成和免疫治疗耐药。
本研究证实了外周血IL-6、CD8+T细胞和PNI在预测不可切除HCC患者免疫治疗反应中的价值，这与前人研究一致。IL-6主要由CAFs和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分泌，可促进肿瘤进展。CD8+T细胞是发挥抗肿瘤作用的主要免疫细胞。PNI则反映了机体的营养和免疫状态。这些无创生物标志物为临床实践提供了便利。
研究的局限性在于未通过细胞实验验证TGF-β信号通路的具体作用，也未明确CAFs释放的何种细胞因子参与了巨噬细胞M2极化，IL-6可能是主要候选因子。此外，预测模型的样本量有待扩大，未来可整合影像组学特征等更多信息，并探索更先进的机器学习方法以提升模型精度。
5 结论
本研究开发了一个基于TDEI基因的预后模型，可用于预测HCC患者的预后、TME变化及免疫治疗反应。该模型可作为HCC患者的独立预后因素，凸显了TDEI基因的功能和意义。此外，外周血IL-6、CD8+T细胞计数和PNI可作为预测不可切除HCC患者免疫治疗反应的无创生物标志物，为HCC的精准免疫治疗提供了新的见解和策略。
