《Frontiers in Oncology》：Integrated single-cell and spatial transcriptomics combined with whole-exome sequencing reveal key hub genes and epithelial heterogeneity in bladder cancer
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本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（ST）、全外显子测序（WES）及机器学习算法，系统解析了膀胱癌（BLCA）肿瘤微环境（TME）中与肿瘤突变负荷（TMB）相关的上皮细胞（EpiCs）异质性。研究鉴定出关键上皮亚群Epi14，并发现枢纽基因ABRACL与ARPC3与TMB、患者预后及化疗敏感性显著相关，其空间共表达模式及细胞通讯网络为BLCA的精准治疗提供了新视角。
引言
膀胱癌（BLCA）是泌尿系统常见恶性肿瘤，其肿瘤微环境（TME）复杂且肿瘤突变负荷（TMB）具有高度异质性。癌症相关上皮细胞（EpiCs）在BLCA发生发展中表现出显著异质性，阐明其多样性及功能状态对改善诊断和治疗策略至关重要。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（ST）、全外显子测序（WES）及机器学习（ML）技术的发展为深入解析TME、探索TMB相关机制及发现关键分子驱动因子提供了前所未有的机遇。
材料与方法
研究整合了多组学数据集，包括13例scRNA-seq样本、514例批量转录组数据及30例WES样本。通过非线性降维（UMAP）和聚类分析识别主要上皮亚群，并进行二次聚类。利用自身生成的WES数据计算TMB值，结合scAB和Ro/e算法确定TMB相关上皮亚集，最终锁定关键簇Epi14。分析Epi14的差异表达基因（DEGs），采用CellChat推断细胞间通讯网络，应用CytoTRACE和Monocle2评估干性潜能和分化轨迹。结合随机生存森林（RSF）与DEG分析鉴定枢纽基因，并开展免疫浸润、药物敏感性、功能通路及空间转录组分析。最后通过qPCR和Western blot在肿瘤与癌旁组织中验证枢纽基因表达。
结果
单细胞图谱揭示BLCA主要细胞簇
研究共纳入77,263个细胞和3,000个高变基因，鉴定出32个注释细胞簇，进一步归类为10种主要细胞类型，包括T细胞、B细胞、成纤维细胞、上皮细胞、单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞、浆细胞、树突状细胞和肥大细胞。比较正常与肿瘤组织显示细胞比例存在显著差异。
上皮细胞再聚类与TMB相关DEGs鉴定
上皮细胞经二次聚类获得19个上皮亚群（Epi0–Epi18）。scAB算法结合TMB值识别出与高TMB显著相关的细胞（scAB细胞），Ro/e分析表明scAB细胞主要富集于Epi14亚群。差异表达分析鉴定出119个显著DEGs（|log2FC| > 0.585，FDR < 0.05），功能富集分析显示这些基因主要与核糖体和呼吸链复合物相关。
细胞通讯、分化状态与伪时间轨迹
CellChat分析揭示TMB-Epi细胞与内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞之间存在强烈的相互作用，其中MDK–SDC1和MDK–NCL信号轴是成纤维细胞向TMB-Epi细胞通讯的关键途径。CytoTRACE分析显示Epi14具有中高干性状态。Monocle2伪时间轨迹重建表明TMB-Epi细胞主要位于分化早期阶段，枢纽基因ABRACL和ARPC3的表达随分化进程呈上升趋势。
机器学习与多数据集整合鉴定枢纽基因ABRACL和ARPC3
RSF算法筛选出ABRACL、ARPC3、BHLHE41和STRAP四个候选基因，其中ABRACL和ARPC3在肿瘤组织中一致性上调，且ABRACL高表达组TMB值显著升高。生存分析显示四基因均与总生存期（OS）显著相关。
免疫浸润、通路富集与药物敏感性
CIBERSORT分析显示肿瘤组织免疫浸润谱与正常组织差异显著，ABRACL表达与记忆B细胞、滤泡辅助T细胞和活化树突状细胞呈正相关，ARPC3与记忆B细胞、静息NK细胞和静息树突状细胞正相关。GSEA和GSVA提示ABRACL富集于p53信号通路、2-氧代羧酸代谢等，ARPC3与B细胞受体信号通路、NF-κB通路相关。药物敏感性预测表明ABRACL和ARPC3高表达组对吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和顺铂等化疗药物更敏感。
空间转录组学分析
空间转录组数据去卷积显示上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和免疫细胞在组织中分布异质。CellChat重建细胞通讯网络，发现TMB-Epi细胞与基质细胞通过MDK–SDC1、MDK–SDC4和PTN–SDC1等信号轴密切互动。PROGENy通路活性分析显示TMB-Epi细胞中JAK-STAT、TNFα和NF-κB通路显著激活。ABRACL和ARPC3在肿瘤高密度区域（BLCA-B2）空间共表达显著。
实验验证
qPCR和Western blot结果一致证实ABRACL和ARPC3在BLCA肿瘤组织中的mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁组织。
讨论与结论
本研究通过多组学整合策略，揭示了BLCA中TMB相关上皮细胞亚群Epi14的空间分布、通讯特征及关键调控基因。TMB-Epi细胞作为信号枢纽，与基质细胞通过特定配体-受体对互动，并激活JAK-STAT等促瘤通路。枢纽基因ABRACL和ARPC3与TMB、预后及化疗敏感性密切相关，其空间共定位进一步支持了它们在肿瘤上皮重塑中的核心作用。这些发现为BLCA的分子异质性和空间调控机制提供了新见解，并为针对TMB相关上皮亚群的精准治疗策略开发奠定了基础。
