《Frontiers in Immunology》：Repetitive transcranial magnetic stimulation alleviates neuropathic pain via microglial polarization by modulating the METTL3/NMDAR2B/NLRP3 pathway
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本文系统阐述了重复经颅磁刺激（rTMS）通过调控METTL3介导的m6A甲基化修饰，影响NMDAR2B/NLRP3信号轴，进而调节小胶质细胞M1/M2极化状态，最终缓解神经病理性疼痛（NeuP）及其共病抑郁行为的新机制。研究为rTMS的临床应用提供了创新分子靶点，深化了对神经炎症与疼痛交互作用的理解。
引言
神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NeuP）是一种由躯体感觉神经系统损伤或疾病直接导致的慢性疼痛，约占所有慢性疼痛病例的7%–10%。现有的药物治疗方案，如钙通道阻滞剂、三环类抗抑郁药和阿片类药物，对约40%–60%的患者无法提供有效的疼痛缓解。此外，慢性NeuP常伴随焦虑、抑郁等情绪障碍以及认知功能障碍，严重损害患者的生活质量并带来沉重的社会经济负担。
重复经颅磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation, rTMS）作为一种非侵入性神经调控技术，已被广泛应用于治疗中风、脊髓损伤、创伤性脑损伤等继发的瘫痪、疼痛、痉挛和认知障碍。既往研究表明，针对初级运动皮层或前额叶皮层（Prefrontal Cortex, PFC）的rTMS能有效缓解包括NeuP在内的多种慢性疼痛。小胶质细胞在激活状态下可分为促炎的M1型和抗炎的M2型。M1型小胶质细胞的异常增加是NeuP发生的关键因素。近期证据表明，促使小胶质细胞极化从M1型向M2型转变是NeuP有前景的治疗策略之一。作者前期研究提示，rTMS可能通过调节小胶质细胞M1/M2极化和减轻神经炎症来缓解NeuP，但其精确分子机制尚需深入探索。
表观遗传机制，即在不改变DNA序列的情况下调控基因表达，已被认为是NeuP发病的关键因素之一。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最常见的转录后修饰。m6A修饰由一个复杂的系统动态调控，包括甲基转移酶（如甲基转移酶样蛋白3（METTL3）和甲基转移酶样蛋白14（METTL14））、去甲基化酶（如脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5））以及识别蛋白（如YTH结构域家族蛋白（YTHDF））。这些调节因子共同影响mRNA的剪接、运输、稳定性和翻译效率等多个方面。近期研究表明，m6A甲基化可能在NeuP的发生和维持中起关键作用。
METTL3是一种关键的m6A甲基转移酶，通过影响神经炎症和疼痛信号通路在NeuP中扮演重要角色。研究报道在慢性坐骨神经压迫性损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）模型中METTL3表达升高，而在CCI大鼠中抑制METTL3可改善疼痛相关行为。前期研究发现METTL3可在大鼠模型中调节小胶质细胞M1/M2极化，提示METTL3可能是NeuP的潜在治疗靶点。另有研究显示，S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine, SAH，一种METTL3-METTL14复合物抑制剂）可降低N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基（N-methyl-D-aspartate receptor subtype 2B, NMDAR2B）的表达，并缓解子宫颈扩张模型大鼠的疼痛。NMDAR2B是兴奋性谷氨酸受体的关键亚基，在某些病理条件下（如NeuP）可能促进小胶质细胞M1极化，并在NeuP的转变阶段发挥关键作用。此外，一些研究表明NMDAR2B可能参与调节NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3, NLRP3）炎症小体的活化，而NLRP3炎症小体也通过触发白细胞介素（Interleukin, IL）-1β和IL-18等促炎细胞因子的成熟和释放参与NeuP。同时，在脊髓损伤模型中发现NLRP3炎症小体与小胶质细胞M1/M2极化相关。这些研究提示METTL3/NMDAR2B/NLRP3通路可能参与小胶质细胞极化介导的神经炎症。
前期研究表明，深部脑刺激可通过降低METTL3的表达来缓解创伤后应激障碍行为，而作者早期研究证实rTMS通过降低NMDAR2B表达来改善NeuP及相关行为。rTMS也被证明可在多种疾病模型中抑制NLRP3的活化。基于这些发现，本研究旨在探讨METTL3/NMDAR2B/NLRP3信号通路在rTMS治疗NeuP效应中的作用。
材料与方法
本研究采用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200-240克，随机分为对照组（Control）、CCI假刺激组（CCI+Sham）和CCI+rTMS治疗组（CCI+rTMS），每组5只。通过结扎坐骨神经建立CCI诱导的NeuP模型。于造模后第7天开始，对rTMS组大鼠进行为期4周（每周5天）的rTMS治疗，刺激靶点为背外侧前额叶皮层（Dorsolateral Prefrontal Cortex, DLPFC），参数为10 Hz频率，100%静息运动阈值，每次1000个脉冲。假刺激组接受相同束缚和听觉刺激但无磁场输出。在指定时间点进行行为学评估，包括机械缩足阈值（Paw-Withdrawal Mechanical Threshold, PWMT）、热痛缩足潜伏期（Paw-Withdrawal Latency, PWL）、坐骨神经功能指数（Sciatic Nerve Function Index, SFI）、强迫游泳测试（Forced Swimming Test, FST）和新物体偏好指数（Novel Object Preference Index, NPI）。行为测试结束后处死大鼠，取DLPFC脑区进行分子指标分析。
体外实验采用BV2小胶质细胞系，用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS; 100 μg/mL）刺激12小时诱导神经炎症和M1极化。细胞分为7组：对照组（Con）、LPS组、LPS+磁刺激组（LPS+MS）、LPS+METTL3抑制组（LPS+sh-METTL3）、LPS+METTL3过表达+磁刺激组（LPS+METTL3-OE+MS）、LPS+NMDAR2B抑制组（LPS+sh-NMDAR2B）、LPS+NMDAR2B过表达+磁刺激组（LPS+NMDAR2B-OE+MS）。采用STM2457抑制METTL3，METTL3-activator-1激活METTL3；采用D-AP5抑制NMDAR2B，D-丝氨酸（D-Serine）激活NMDAR2B。磁刺激参数为10 Hz，持续48小时（每24小时一次）。通过免疫荧光、Western blot、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测相关蛋白、mRNA和细胞因子水平。
结果
rTMS改善疼痛和抑郁相关行为并促进坐骨神经恢复
术前，三组大鼠在PWMT、PWL、FST不动时间、NPI和SFI上无显著差异。造模后1周，与对照组相比，CCI+Sham组和CCI+rTMS组的PWMT、PWL和SFI显著降低，同时FST不动时间增加，NPI值降低，表明NeuP模型成功建立并伴有抑郁样行为。
干预2至5周后，CCI+Sham组的PWMT、PWL和SFI显著低于对照组。CCI+rTMS组在干预1周后，PWMT、PWL和SFI开始升高。至第3周，CCI+rTMS组的PWL显著高于CCI+Sham组；第4周，PWMT和SFI也显著高于CCI+Sham组。此外，与CCI+Sham组相比，CCI+rTMS组在第3周后FST不动时间缩短，第4周后NPI升高。结果表明rTMS能有效改善CCI诱导的疼痛行为和共病抑郁样行为。
磁刺激促使小胶质细胞从M1型向M2型转化并调节神经炎症
体内实验显示，造模后5周，与对照组相比，CCI+Sham组大鼠DLPFC区IL-6和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）水平升高，IL-10水平降低。同时，iNOS mRNA表达增加，TMEM119和Arg1 mRNA表达减少。免疫荧光显示CCI+Sham组DLPFC区M1表型标志物CD86阳性细胞比例增加，M2表型标志物CD206阳性细胞比例减少，表明NeuP模型中小胶质细胞主要极化为促炎的M1表型。
经过4周rTMS干预，CCI+rTMS组与CCI+Sham组相比，IL-6和TNF-α水平显著降低，IL-10水平显著升高。iNOS表达下降，TMEM119和Arg1表达上升。同时，CD86阳性细胞比例减少，CD206阳性细胞比例增加。这些结果提示rTMS可抑制小胶质细胞向M1表型极化，促进其向M2表型极化，从而调节神经炎症，恢复内环境稳定。
体外实验进一步验证了上述发现。与对照组相比，LPS刺激的BV2细胞中NLRP3、IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低；小胶质细胞标志物Iba-1表达增加，CD86阳性细胞比例显著升高，CD206阳性细胞比例显著降低。经过2天磁刺激处理后，MS组与LPS组相比，NLRP3、IL-6、TNF-α水平下降，IL-10水平上升；同时Iba-1和CD86表达显著减少，CD206表达显著增加。结果表明磁刺激在体外也能逆转LPS诱导的M1极化，促进M2极化，减轻炎症反应。
磁刺激下调METTL3、m6A甲基化、NMDAR2B和YTHDF1
体内Western blot和qRT-PCR分析显示，与对照组相比，CCI+Sham组大鼠DLPFC区METTL3、m6A甲基化水平、NMDAR2B和YTH结构域家族蛋白1（YTH Domain-Containing Family 1, YTHDF1）的表达均显著升高。经过4周rTMS治疗，CCI+rTMS组这些标志物的水平显著降低。
体外实验证实了磁刺激对LPS诱导的BV2细胞的影响。与对照组相比，LPS组METTL3、m6A、NMDAR2B和YTHDF1水平升高。磁刺激处理后，MS组这些标志物的水平显著下降，与体内观察结果一致。表明rTMS/磁刺激能有效调控METTL3/m6A/YTHDF1/NMDAR2B信号轴。
METTL3和NMDAR2B在磁刺激调节小胶质细胞极化中的作用
为阐明METTL3和NMDAR2B在磁刺激调节小胶质细胞极化和神经炎症中的作用，研究进行了药理学干预。体外实验表明，与对照组相比，抑制METTL3可降低YTHDF1和NMDAR2B的表达；过表达METTL3则升高YTHDF1和NMDAR2B水平。然而，抑制或过表达NMDAR2B并未改变METTL3或YTHDF1的表达，提示NMDAR2B位于METTL3下游。
与LPS组相比，LPS+sh-METTL3组和LPS+sh-NMDAR2B组m6A、NLRP3、IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高；Iba-1、CD86阳性细胞比例减少，CD206阳性细胞比例增加。表明抑制METTL3或NMDAR2B能缓解LPS诱导的神经炎症和M1极化。
相比之下，LPS+METTL3-OE+MS组和LPS+NMDAR2B-OE+MS组与LPS+MS组相比，表现出更多的Iba-1和CD86阳性细胞，CD206表达降低，m6A、NLRP3、IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低。说明过表达METTL3或NMDAR2B逆转了磁刺激促进M2极化和抗神经炎症的效果。这些结果证实METTL3和NMDAR2B是磁刺激调节小胶质细胞极化和神经炎症的关键介质。
讨论
本研究采用“表型到分子”的设计策略。为期4周的rTMS干预后，行为学测试证实了rTMS对CCI诱导的疼痛和抑郁行为的改善作用，为后续分子分析提供了生物学相关性基础。与作者前期研究一致，rTMS显著提高了PWMT、PWL和SFI，改善了疼痛相关指标，同时减少了FST不动时间，增加了NPI，缓解了抑郁样行为。
在分子水平，磁刺激处理降低了CCI大鼠和LPS刺激的BV2细胞中Iba-1和CD86（M1标志物）的表达，提高了CD206（M2标志物）的表达；降低了促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平，提高了抗炎细胞因子IL-10的水平；并下调了m6A甲基化水平以及METTL3、YTHDF1和NMDAR2B的表达。通过靶向抑制和激活实验，进一步证实METTL3和NMDAR2B是磁刺激调节小胶质细胞极化和神经炎症的关键分子靶点。
关于刺激靶点的选择，DLPFC作为参与认知、情绪和感觉处理的关键脑区，在慢性疼痛患者中常表现出功能异常。本研究采用的10 Hz、左侧DLPFC刺激方案，与FDA批准的难治性抑郁症rTMS治疗参数一致，并有大量临床证据支持其对NeuP的疗效。
神经炎症，特别是由小胶质细胞极化介导的神经炎症，在NeuP的发生发展中起核心作用。本研究体内外实验结果均表明，rTMS/磁刺激可通过抑制M1极化、促进M2极化来调节神经炎症，这可能是其缓解疼痛的重要机制。这一发现与rTMS在抑郁症、脑缺血等疾病模型中调节小胶质细胞极化的研究结果相呼应，提示调节神经炎症是小胶质细胞极化是rTMS发挥治疗效应的共同通路之一。
研究发现CCI大鼠和LPS刺激的微胶质细胞中METTL3、m6A甲基化、YTHDF1和NMDAR2B显著上调，rTMS干预后其表达下降。药理学实验证明抑制METTL3或NMDAR2B可缓解神经炎症和M1极化，而过表达则抵消磁刺激的益处。这些结果凸显了METTL3和NMDAR2B在rTMS效应中的关键地位。研究还发现NMDAR2B的表达受METTL3调控，且抑制或过表达NMDAR2B不影响METTL3/YTHDF1表达，表明NMDAR2B是METTL3的下游靶点。这与前人关于METTL3通过m6A修饰调控NMDAR2B表达的研究一致。
此外，研究观察到抑制METTL3或NMDAR2B导致NLRP3表达降低，而激活则增加其表达。磁刺激干预显著降低了NLRP3水平。结合文献报道NLRP3抑制剂可缓解疼痛，NMDAR2B可调节NLRP3表达，以及rTMS可抑制NLRP3活化，本研究推测NLRP3可能作为METTL3/NMDAR2B通路的下游效应分子，介导磁刺激对小胶质细胞极化的调节，从而改善神经炎症和NeuP。
结论
本研究探讨了rTMS通过调节METTL3介导的m6A甲基化影响小胶质细胞极化的机制。研究结果表明，METTL3/NMDAR2B/NLRP3信号轴在NeuP的发病和进展中起关键作用。具体而言，rTMS可能通过下调METTL3表达和m6A甲基化水平，减少YTHDF1介导的NMDAR2B翻译，抑制NLRP3炎症小体活化，并促进小胶质细胞向M2表型极化，从而调节神经炎症，最终缓解NeuP及其相关的抑郁样行为。
局限性
本研究存在一些局限性。首先，未在动物水平进行METTL3或NMDAR2B的敲低或过表达实验，以在体内验证METTL3/NMDAR2B轴的作用。其次，研究集中于DLPFC区域，而脑功能是复杂的网络调控，rTMS对DLPFC的刺激是否影响其他脑区尚不清楚。第三，将研究发现转化到临床应用仍受限于物种间颅骨厚度、线圈与皮层距离的差异，以及缺乏经过验证的METTL3/m6A生物标志物。未来需要进行更大规模、影像引导和假刺激对照的临床试验来确定其实际疗效。
