宏基因组下一代测序（mNGS）在肾移植受者真菌感染诊断中的价值：一项回顾性研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Metagenomic next-generation sequencing enhances diagnosis of fungal infections in kidney transplant recipients: a retrospective study

　　

摘要 背景：尽管真菌感染相对罕见，但其检测率低、死亡率高。宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）在肾移植患者真菌感染中的价值，尤其在诊断和抗微生物药物管理方面，仍未被充分探讨。 方法：2021年9月至2023年8月期间，纳入234名肾移植患者，其中66名疑似真菌感染患者的详细数据被收集。研究人员比较了mNGS与传统微生物检测（conventional microbiological tests, CMTs）的病原体检出性能，并评估了mNGS和CMTs对治疗调整的影响。最后，探讨了mNGS在检测供体来源感染（donor-derived infection, DDI）方面的价值。 结果：在66名患者中，共鉴定出21种真菌：mNGS检测到18种，CMTs检测到10种。mNGS的总阳性率显著高于培养法（90.67% vs. 26.67%），尤其在多重真菌感染（9例 vs. 0例）方面优势明显。与CMTs相比，mNGS检出了更多的念珠菌（Candida）（26例 vs. 12例）、耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）（14例 vs. 0例）、曲霉菌（Aspergillus）（10例 vs. 4例）和毛霉菌（Mucor）（6例 vs. 2例）微生物。在11名（6.7%）患者中鉴定出供体来源真菌，包括10例念珠菌和1例毛霉菌。基于mNGS结果，28例（24.4%）患者的抗感染治疗方案得到了调整。 结论：mNGS技术在检测肾移植患者真菌感染方面显示出显著优势，有助于制定明智的抗感染策略并加强对移植物的保护。此外，该技术为供体来源的真菌感染提供了有效识别手段。

一、研究背景、问题与动机

肾移植受者因长期免疫抑制，面临危及生命的侵袭性真菌感染（IFIs）高风险。尽管侵袭性真菌感染占移植后并发症的比例不足5%，但其死亡率却不成比例地高。供体来源感染（DDI）虽不常见，却会导致显著的发病率和死亡率，其中真菌相关疾病的移植物丢失或死亡风险尤为高。及时诊断是主要挑战，因为传统的培养方法速度慢、灵敏度低，而非培养检测方法又存在显著局限性。

宏基因组下一代测序（mNGS）可解决当前诊断的局限性，并已越来越多地应用于临床病原体检测。已有研究表明mNGS可提高真菌感染检测的灵敏度。然而，关于mNGS在肾移植患者真菌感染诊断中的应用研究较少，其在检测和表征供体来源真菌感染方面的作用更是基本未被探索。因此，本研究旨在评估mNGS在肾移植受者真菌感染诊断中的性能，并与传统方法进行比较，评估其对治疗管理的临床影响，特别是在探索mNGS识别供体来源真菌感染的潜力方面提供新的见解。本论文发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》期刊。

二、主要关键技术方法

本研究为一项回顾性研究，在2021年9月至2023年8月期间，在安徽医科大学第一附属医院对肾移植受者进行。

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   样本来源：从234名移植受者中收集的395份样本中，最终分析了来自66名患者的75份样本，包括支气管肺泡灌洗液（BALF）、引流液、血液、器官保存液和痰液。
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   对比方法学：所有样本均同时接受mNGS和传统微生物检测（CMTs，包括染色、培养、血清(1,3)-β-D葡聚糖和半乳甘露聚糖检测）进行分析。
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   mNGS流程：样本送至北京Hugobiotech有限公司。采用DNA-only或DNA与RNA结合方案进行测序。通过QIAamp DNA Micro Kit提取DNA，使用Illumina Nextseq 550平台进行测序。数据处理时，先过滤低质量、人源序列，再将剩余数据与包含超过30,000种微生物基因组的数据库进行比对。阳性结果的判定依据特定序列覆盖度、reads per million (RPM)阈值及阴性对照对比。
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   数据分析：使用配对资料的McNemar检验等方法比较mNGS与CMTs的阳性率差异。

三、研究结果

1. 样本和患者特征

研究纳入66名患者，平均年龄43.7±9.6岁，男性占59.09%。最常见的合并症是贫血（53.03%）。患者中位住院时间为28.5天，27.27%的患者需进入ICU。总死亡率为15.15%。在10名死亡患者中，7人患有真菌血流感染。样本类型分布如下：引流液和支气管肺泡灌洗液（BALF）各占30.67%，器官保存液占20.00%，血液占17.33%，痰液占1.33%。

2. mNGS与CMTs检测到的真菌种类分布

在66名患者中共鉴定出21种真菌，mNGS检测到18种，CMTs检测到10种。mNGS最常检测到的病原体是耶氏肺孢子菌（14例）、白色念珠菌（Candida albicans）（12例）和近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）（6例）。mNGS检出念珠菌26例、曲霉菌10例、毛霉菌6例。9名患者存在多重真菌感染。CMTs检出的最常见种类是白色念珠菌和光滑念珠菌（Candida glabrata），仅检测到1例多重真菌感染。mNGS在检测真菌种类多样性方面显著优于CMTs。

3. mNGS检测到的混合感染

mNGS在75份样本中的57份中检测到混合感染（指两种或以上病原体）。最常见模式是细菌-真菌共感染（28%），其次是细菌-病毒-真菌三重感染（25.33%）。在器官保存液和引流液中也检测到27例混合感染，以细菌-真菌共感染（44.74%）为主。值得注意的是，mNGS在9份样本中鉴定出多真菌种感染，而CMTs仅检测到1例。

4. mNGS与CMTs诊断性能比较

mNGS在真菌检测中的总阳性率（90.67%）显著高于CMTs（26.67%）。在75例中，mNGS单独阳性占73.33%，CMTs单独阳性占9.33%，两者均阳性占13.33%。在两者均阳性的病例中，结果完全一致、部分一致和不一致的分别占9.33%、4%和4%。整体上，mNGS比CMTs检出了更多的念珠菌、曲霉菌和毛霉菌。CMTs漏检的病原体包括无法常规培养的耶氏肺孢子菌等，而mNGS漏检的包括酵母菌、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）等。

5. 供体来源的真菌感染

在2021年9月至2023年8月期间接受心脏死亡后捐献（DCD）肾移植的146名患者中，对器官保存液和/或引流液进行分析。在35名患者的41份样本中检测到真菌。其中，在11名（7.5%）患者中鉴定出供体来源的真菌感染，包括10例念珠菌和1例毛霉菌。这11名患者中有2例死亡，1例死于细菌感染，另1例死于播散性毛霉病。检测方法上，4例仅依赖mNGS，4例仅依赖CMTs，3例两者均依赖。

6. mNGS对抗菌治疗应用的影响

mNGS结果指导了42.4%（28/66）患者的治疗方案调整。调整主要体现在两方面：一是启动靶向治疗，如为曲霉菌感染加用伏立康唑，为耶氏肺孢子菌感染加用磺胺甲噁唑；二是实现治疗降阶梯，如在13名患者中停用卡泊芬净。对于大多数治疗方案未变的患者，mNGS验证了初始经验性卡泊芬净治疗的适当性。

四、讨论与结论总结

讨论部分强调了mNGS在肾移植受者真菌感染管理中的价值与挑战。mNGS显著更高的真菌检出率（尤其是对耶氏肺孢子菌等苛养或不可培养真菌）与免疫受损人群的其他研究一致。mNGS在识别真菌种类和共感染病原体方面表现出色，有助于指导抗微生物治疗。本研究中，mNGS直接影响了抗真菌管理，支持了靶向治疗的启动和不必要药物的停用。

关于供体来源感染（DDI），本研究通过系统应用mNGS和CMTs对保存液和引流液进行检测，发现了7.5%的供体来源真菌感染率，高于早期荟萃分析报告的4%，这可能归因于联合检测策略。所有供体来源的念珠菌感染均被成功管理，无受者死亡，这可能反映了本中心术后常规使用卡泊芬净预防及后续根据病原学证据调整治疗的策略。一例致命的供体来源毛霉菌感染病例，突显了mNGS等敏感检测工具在识别常规筛查可能漏检的高危罕见病原体方面不可或缺的作用。

研究也指出了mNGS的局限性，包括：1）无法可靠区分定植与活动性感染，需结合临床综合判断；2）不提供药敏结果；3）对于曲霉菌等具有厚细胞壁的真菌，可能存在核酸提取困难导致的假阴性。

研究结论翻译：mNGS技术在检测肾移植患者真菌感染方面显示出显著优势，有助于制定明智的抗感染策略并加强对移植物的保护。此外，该技术为供体来源的真菌感染提供了有效识别手段。