《Journal of Advanced Research》：Targeted delivery of senolytic drugs using macrophage membrane-camouflaged magnetic nanoparticles inhibits endplate sclerosis
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本研究针对慢性肾脏病（CKD）中肾纤维化治疗靶点匮乏的难题，揭示了内质网（ER）应激通过转录因子CHOP上调跨膜蛋白EVA1A的表达。研究人员发现EVA1A作为分子适配器，在ER腔内通过其N端结构域与TGF-β受体II型（TGFBR2）相互作用，并招募分子伴侣BIP形成复合物，稳定TGFBR2蛋白并促进其从ER向质膜转运，从而激活TGF-β/SMAD信号通路，最终加剧肾纤维化。该研究首次阐明了EVA1A介导ER应激与TGF-β信号通路交叉对话的新机制，为CKD的靶向治疗提供了潜在新靶点。
当肾脏长期遭受各种损伤因素攻击时，会逐渐发展成慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD），其特征性的病理改变是肾纤维化。这种纤维化过程如同器官内部悄然滋生的"疤痕"，会取代正常的肾单位，导致肾功能不可逆地丧失，最终走向终末期肾病。目前临床上针对肾纤维化依然缺乏有效的治疗手段，这主要是由于其背后复杂的分子机制尚未被完全揭示。在细胞内部，内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）是蛋白质合成、折叠和修饰的重要场所，当细胞受到应激时，内质网功能会发生紊乱，即发生内质网应激（ER Stress）。既往研究表明，内质网应激和转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-beta, TGF-β）信号通路的激活都在肾纤维化中扮演重要角色，但这两个关键事件之间是如何联系起来的，一直是一个模糊地带。
为了解决这一科学问题，来自南方医科大学的高琼丹、王振坤等研究人员在《Journal of Advanced Research》上发表了一项研究，他们将目光投向了一个名为EVA-1同源物A（EVA1A）的蛋白质。EVA1A是一个定位于内质网的跨膜蛋白，此前已知其参与调控自噬和凋亡。那么，它是否会在慢性肾脏病的肾纤维化中起作用，并成为连接内质网应激与TGF-β信号通路的关键分子呢？
为了回答这个问题，研究团队运用了多种技术方法。他们首先利用公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和临床样本，验证了EVA1A在CKD患者和小鼠纤维化肾脏中的表达情况。接着，他们构建了全身性诱导性敲除（Eva1a-/-）和肾近端小管特异性敲除（Eva1aP-/P-）的小鼠模型，并让这些小鼠经历单侧输尿管结扎（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）和单侧缺血再灌注损伤（Unilateral Ischemia-Reperfusion Injury, UIRI）这两种经典的肾纤维化模型，从整体动物水平评估Eva1a缺失对肾损伤和纤维化的影响。反之，他们也在小鼠体内过表达了EVA1A蛋白，观察其效应。在机制探索层面，研究人员采用了RNA测序（RNA-seq）分析、基因集富集分析（GSEA）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）、流式细胞术、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫组织化学/免疫荧光染色以及质谱分析等技术，深入揭示了EVA1A调控TGF-β信号通路的具体分子机制。
EVA1A在CKD患者和模型小鼠的纤维化肾脏中表达上调
研究人员发现，与健康供者相比，EVA1A在CKD患者的肾脏，尤其是肾近端小管中表达显著升高，且其表达水平与纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原蛋白I（Collagen-I）呈正相关。在UUO和UIRI诱导的CKD模型小鼠的肾组织中，EVA1A的蛋白水平也随着纤维化蛋白（如纤维连接蛋白FN、α-SMA、Collagen-I）的增加而显著上调。这些结果提示EVA1A可能与CKD的进展密切相关。
敲除Eva1a可减轻CKD模型小鼠的肾纤维化
为了探究EVA1A的功能，研究者在Eva1a敲除小鼠中进行了UUO和UIRI手术。结果表明，与野生型（WT）小鼠相比，Eva1a缺失显著减轻了模型小鼠的肾损伤（表现为肾脏损伤分子1 KIM-1、血清肌酐、血尿素氮BUN水平降低）和肾纤维化（表现为FN、α-SMA、Collagen-I等纤维化标志物表达下降）。组织染色结果（如Masson染色、HE染色）也直观地证实了Eva1a敲除对肾纤维化和组织损伤的缓解作用。
肾近端小管特异性敲除Eva1a同样减轻肾纤维化
通过分析公共数据库和进行免疫荧光共染色，研究人员确认EVA1A主要在肾近端小管和远端小管段高表达。他们进一步构建了肾近端小管特异性敲除Eva1a的小鼠（Eva1aP-/P-）。在UUO和UIRI模型中，这些特异性敲除小鼠也表现出与全身性敲除小鼠相似的表型：肾纤维化和损伤显著减轻。这证明了肾近端小管中的EVA1A在肾纤维化中发挥着关键作用。
过表达EVA1A加重UUO模型小鼠的肾损伤和纤维化
为了进一步确认EVA1A的作用，研究团队通过尾静脉注射在UUO小鼠体内过表达了EVA1A。结果发现，过表达EVA1A会加剧肾纤维化和损伤，表现为肾组织中FN、Collagen-I、α-SMA和KIM-1的蛋白水平进一步升高。这一增益功能实验从反面证实了EVA1A在促进肾纤维化中的积极作用。
内质网应激通过CHOP上调EVA1A的表达
机制探索的第一步，研究人员发现CKD模型小鼠肾脏中内质网应激相关蛋白（如CHOP、IRE1α、BIP、ATF4）的表达与EVA1A同步上调。在体外实验中，用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）处理野生型小鼠原代肾小管上皮细胞时，EVA1A表达增加；但在Chop基因敲除的细胞中，这种上调效应被取消。在体实验中，UUO处理的Chop敲除小鼠其肾脏EVA1A的上调以及纤维化程度均受到抑制。这些结果说明，在CKD中，内质网应激是通过转录因子CHOP来上调EVA1A表达的。
Eva1a缺失抑制TGF-β信号通路
为了阐明下游机制，研究者对UUO处理的WT和Eva1a敲除小鼠的肾脏进行了RNA测序分析。基因集富集分析显示，TGF-β信号通路在Eva1a敲除小鼠的肾脏中显著下调。在细胞水平上，Eva1a敲除削弱了TGF-β1刺激引起的SMAD2/3磷酸化（p-SMAD2/3）以及纤维化蛋白的上调；而过表达EVA1A则增强了TGF-β信号通路的活性。在动物模型中，Eva1a敲除降低了UUO引起的TGFBR2蛋白水平和p-SMAD2的升高，而过表达EVA1A则产生相反效果。值得注意的是，Tgfbr2的mRNA水平并未改变，提示EVA1A是在蛋白质层面调控TGFBR2。
Eva1a缺失损害TGFBR2的质膜定位和蛋白稳定性
流式细胞术分析显示，Eva1a敲除降低了TGFBR2在细胞膜上的定位，同时导致TGFBR2在内质网（与标志物KDEL共定位）积聚。进一步的实验发现，Eva1a敲除增强了TGFBR2蛋白的泛素化修饰，而使用蛋白酶体抑制剂MG132处理可以恢复Eva1a敲除细胞中TGFBR2的总量及其在膜上的定位，并部分恢复TGF-β信号通路的活性。这表明EVA1A通过影响TGFBR2的稳定性及其向质膜的转运来调控TGF-β信号。
EVA1A通过其N端结构域在ER内与TGFBR2相互作用
免疫共沉淀和双分子荧光互补实验证实了EVA1A与TGFBR2之间存在直接的相互作用。通过构建EVA1A的不同结构域缺失突变体（ΔC, ΔN, ΔTM），研究人员发现其N端结构域和跨膜结构域对于与TGFBR2的结合至关重要。重要的是，只有表达野生型EVA1A，而非缺失N端的突变体（ΔN），才能有效增强TGF-β信号通路的活性，说明EVA1A是通过其N端与TGFBR2相互作用来发挥功能的。
BIP参与EVA1A与TGFBR2的相互作用及TGF-β信号通路的激活
质谱分析发现分子伴侣BIP（也称为HSPA5）与EVA1A和TGFBR2都存在相互作用。免疫共沉淀实验证实了这一点，并且敲低EVA1A会减少BIP与TGFBR2的结合，而敲低BIP则会削弱EVA1A与TGFBR2的相互作用，并抑制EVA1A过表达所导致的TGFBR2膜定位增加和TGF-β信号通路激活。这表明BIP被EVA1A招募到EVA1A-TGFBR2复合物中，协助TGFBR2的折叠和转运。
综上所述，这项研究描绘了一条清晰的信号轴：在慢性肾脏病进程中，内质网应激通过CHOP上调EVA1A的表达；升高的EVA1A蛋白作为分子适配器，其N端结构域在ER腔内与TGFBR2结合，并招募分子伴侣BIP，共同稳定TGFBR2蛋白，促进其从内质网向细胞质膜的正常运输；到达膜上的TGFBR2得以有效接收胞外TGF-β信号，进而激活下游的SMAD磷酸化级联反应，最终驱动肾纤维化的发生发展。
这项研究的结论和讨论部分强调了其重要意义。它首次揭示了EVA1A作为一个关键节点，巧妙地将细胞内的内质网应激状态与细胞外的TGF-β纤维化信号连接起来。这种机制为理解慢性肾脏病中肾纤维化的发生提供了新的视角。相比于直接靶向具有广泛生理功能的TGF-β或其受体，靶向在病理状态下特异性高表达且功能相对集中的EVA1A，可能为开发治疗肾纤维化及其相关的慢性肾脏病的新型策略提供更高的特异性和安全性，具有重要的转化医学价值。
