靶点验证揭示19-Atriol抑制类固醇合成的真实机制：解耦TSPO并鉴定3β-HSD酶靶点

《Journal of Biological Chemistry》：Target validation uncouples mitochondrial translocator protein from 19-Atriol-mediated inhibition of steroidogenesis and identifies enzymatic targets

本研究针对线粒体转位蛋白（TSPO）是否介导19-Atriol抑制类固醇合成的长期争议，利用CRISPR/Cas9构建的TSPO敲除MA-10细胞模型开展靶点验证。结果表明19-Atriol通过竞争性抑制3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）阻断孕烯醇酮向孕酮转化，其代谢产物19-OHT同样具有抑制活性。该研究颠覆了TSPO介导类固醇合成的传统认知，为精准靶向治疗提供了新视角。

　　

在生命科学的广阔图景中，类固醇激素的生物合成一直是一个充满谜团的研究领域。其中，线粒体转位蛋白（Translocator Protein, TSPO）曾被认为是调控类固醇合成的关键分子，但这一假说近年来受到了基因敲除研究的严峻挑战。尽管多项研究证实TSPO并非类固醇合成所必需，但关于TSPO配体药物能够调节类固醇输出的观点仍在科学界持续存在。这种认知上的矛盾凸显了靶点验证在药物开发中的极端重要性。

在这篇发表在《Journal of Biological Chemistry》上的研究中，研究人员聚焦于一个特定的TSPO配体——19-Atriol（雄甾-5-烯-3β,17β,19-三醇）。早期研究认为19-Atriol通过结合TSPO来抑制孕酮合成，但随着TSPO在类固醇合成中的必要性被基因研究否定，19-Atriol的真实作用机制变得扑朔迷离。为了解决这一科学争议，研究团队采用了严谨的遗传学工具和生化分析方法，旨在揭示19-Atriol抑制类固醇合成的真实分子靶点。

为开展这项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TSPO敲除的MA-10 Leydig细胞模型；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行类固醇激素的精准定量分析；建立3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）活性测定方法；采用免疫印迹技术检测关键蛋白表达；以及运用核磁共振（NMR）和结构建模分析TSPO的胆固醇识别基序。

19-Atriol抑制孕酮合成不依赖于TSPO

研究人员首先比较了野生型MA-10细胞和TSPO敲除（MA-10:Tspo^Δ/Δ）细胞中19-Atriol对孕酮合成的抑制效果。令人惊讶的是，在双丁酰环磷腺苷（Bt₂cAMP）刺激下，19-Atriol在两种细胞中均表现出剂量依赖性的孕酮合成抑制，且抑制效力和最大抑制程度相当。这一结果明确表明，19-Atriol的药理活性不依赖于TSPO表达。进一步实验发现，19-Atriol处理并未改变类固醇合成急性调节蛋白（STAR）和胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）的蛋白水平。当研究人员使用22(R)-羟基胆固醇（22R-HC）绕过胆固醇转运步骤时，19-Atriol仍然能够抑制孕酮产生，提示其作用位点位于胆固醇转运和侧链裂解之后的下游步骤。

19-Atriol抑制HSD3B催化的孕烯醇酮向孕酮转化

为进一步确定19-Atriol的具体作用靶点，研究团队直接评估了它对3β-羟基类固醇脱氢酶（HSD3B）活性的影响。在补充外源性孕烯醇酮（P5）的实验中，19-Atriol以剂量依赖方式显著抑制了P5向孕酮（P4）的转化。值得注意的是，这种抑制模式与经典的HSD3B抑制剂曲洛司坦相似，但在TSPO敲除细胞中同样存在，进一步证实了TSPO非依赖性机制。

19-Atriol被HSD3B代谢为19-OHT，后者也抑制孕酮合成

质谱分析揭示了一个重要发现：19-Atriol本身是HSD3B的底物，能够在细胞内被代谢为19-羟基睾酮（19-OHT）。这种代谢在基础状态和Bt₂cAMP刺激条件下均能发生，且呈浓度依赖性饱和。功能实验表明，19-OHT同样能够以剂量依赖方式抑制孕酮合成，且这种抑制作用在野生型和TSPO敲除细胞中无差异。当绕过胆固醇转运步骤使用22R-HC时，19-OHT仍然有效抑制孕酮产生。更重要的是，在P5补充实验中，19-OHT表现出与19-Atriol相似的竞争性抑制特征，抑制程度随着底物浓度增加而减弱。

19-Atriol和19-OHT对类固醇合成上游步骤的不同抑制作用

研究人员通过同时定量P5和P4水平，深入分析了这两种化合物对类固醇合成通路的不同影响。在Bt₂cAMP刺激下，19-Atriol和19-OHT均能完全抑制P4产生，但与传统HSD3B抑制剂曲洛司坦不同，它们并未引起P5的积累。这一现象提示，除了抑制HSD3B外，这两种化合物还可能影响P5合成的上游步骤。当使用22R-HC绕过胆固醇转运时，19-OHT引起了显著的P5积累，这与单纯HSD3B抑制的表现一致；而19-Atriol仅引起轻微的P5积累，表明它同时部分抑制了CYP11A1活性或胆固醇可用性。

CRAC基序映射不支持19-Atriol靶向TSPO的模型

研究团队还对早期研究中提出的19-Atriol通过TSPO的胆固醇识别氨基酸共识（CRAC）基序发挥作用的假说进行了验证。生物信息学分析发现，TSPO中存在多个CRAC和反向CARC基序，这种基序在蛋白质组中普遍存在，其存在并不等同于胆固醇结合功能。结构建模显示，推定的CRAC-1基序残基分布在螺旋周向，并嵌入线粒体外膜的极性头基区域，不利于特异性胆固醇结合。实验数据表明，任何推定的19-Atriol与TSPO的相互作用都与它的类固醇合成抑制机制无关。

本研究通过严谨的遗传学和生化证据，明确推翻了TSPO介导19-Atriol抑制类固醇合成的传统观点，并成功鉴定了HSD3B作为其直接分子靶点。研究证明19-Atriol不仅是HSD3B的竞争性抑制剂，同时也是其代谢底物，产生的19-OHT代谢物进一步增强了抑制效果。此外，19-Atriol还部分影响CYP11A1活性或胆固醇可用性，而19-OHT则选择性抑制HSD3B。这些发现不仅解决了一个长期的科学争议，更强调了在药物开发中进行严格靶点验证的重要性。对于正在推进临床应用的TSPO结合药物，本研究提示需要重新评估其真实作用机制，以避免基于错误靶点假设的治疗策略。这一研究为理解类固醇合成调控提供了新视角，也为精准靶向治疗的发展奠定了坚实基础。