《Advanced Science》：Protein Language Model-Guided Engineering of a 2,3-Butanediol Dehydrogenase for the Enantioselective Synthesis of Cyclic α-Hydroxy Ketones
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研究以蛋白质语言模型（ESM-1v）为“导航仪”，锁定(2R,3R)-丁二醇脱氢酶（BsBDH）底物口袋关键热点，通过PASS策略先“加固”热稳定性再“精修”立体选择性，获得对cis-1,2-环己二醇（cis-CHD）和trans-1,2-环己二醇（trans-CHD）分别呈>99% ee的突变体10M与LTF，活性最高提升5183倍，为手性α-羟基酮（α-hydroxy ketones）绿色合成提供即用型生物催化剂。
研究速览
从“一锅乱炖”到“分毫不差”——BsBDH的立体选择性大逆转
天然BsBDH对cis-CHD与trans-CHD的活性比仅1.7:1，堪称“脸盲”。作者先用AlphaFold3搭出NAD复合结构，再用Autodock Vina把cis-CHD与(1R,2R)-CHD分别“塞进”口袋，发现115、118、293三位点像“门童”决定客人走向。ESM-1v零样本预测69个单点突变，62个保持活性，其中L118S、F115L直接“翻脸”，偏好trans-CHD， stereoselectivity值从+0.56跌至-1，实现首次“反向歧视”。
先“打地基”再“精装修”——PASS策略让酶“耐热”又“耐造”
野生酶37 °C半衰期仅36 min，难以承受多轮突变。作者提出PASS（Position Analysis and Source Search）策略：先用ΔΔG计算挑出95个“理论上”更稳的突变，再用分子动力学把柔性区>0.2 nm的“软骨头”揪出来，最后用TemBERTure从691条同源序列中筛出“嗜热版”氨基酸偏好。两轮过滤后88.2%预测为稳定者确实更耐热，远高于传统PROSS的35%。六突变体6M2半衰期延长至533 min，T提高9.1 °C，为后续“立体装修”提供坚固脚手架。
“三英战吕布”—— iterative饱和突变把选择性推向极致
以6M2为模板，作者对F115、L118、Y293三热点实施“完美迭代饱和突变”（PISM），每轮19种氨基酸全覆盖，自动机器人iBioFoundry 72 h内完成384块板筛选。结果出炉：
10M（6M2/Y293S/L118F/F50W/W269H）对cis-CHD的cis:trans选择性高达339:1，ee>99%，催化效率k/K与野生型相当，却几乎不碰trans-CHD。
LTF（6M2/F115L/L118T/Y293F）对trans-CHD的trans:cis选择性达476:1，ee>99%，实现“只认右旋”的极端偏好。
高活性双煞6M2/F115C/L118F与6M2/F115L/L118M分别把cis与trans底物的k/K提升94倍与318倍，堪称“动力怪兽”。
“一扇门决定成败”——分子动力学揭开立体歧视最后一层纱
100 ns MD显示，10M口袋内cis-CHD的氢转移攻击角52.4°，而(1R,2R)-CHD仅34.1°，角度“不及格”导致trans底物催化受阻。产物释放自由能计算发现，R-HCH需翻越2.76 kJ mol能垒且存在0.29 nm“能量陷阱”，而S-HCH仅0.56 kJ mol，畅通无阻。进一步隧道面积分析揭示，F50W突变后，W50、F115、I291形成“三足鼎立”的疏水“闸门”，R-HCH离开时需“拆门”，而S-HCH只需“侧身”，立体选择性由此锁定。
“外挂”上场——非天然氨基酸给“门童”装上卤素手电
天然氨基酸“调色盘”不够用？作者引入遗传密码扩展技术，在50位与118位分别植入3-Cl-Phe、3-Br-Phe等卤化非天然氨基酸。结果NC-6M2/Y293S/L118F/F50-2,5-2ClF的cis-CHD活性再升7倍，催化效率达1.02 s mM，为野生型214倍；而NC-6M2/F115L/L118-3BrF对trans-CHD选择性提高至72:1，证实卤素键与空间位阻可“微调”门童手势，让“客人”只能侧肩而入。
“从单环到多环”——突变体横扫25种底物
6M2/F115C/L118F与6M2/F115L/L118M两兄弟不仅“专情”环己二醇，还对1,2-环戊二醇、1,2-茚二醇、3-羟基四氢呋喃等25种二醇与二酮展现“广谱”氧化还原活力，最高提升5183倍。它们把传统化学合成需高温、重金属、多步保护的“苦差”变成30 °C、 pH 8、一锅全细胞的“绿色派对”。
“细胞工厂”开足马力——>99% ee手性α-羟基酮克级制备
将10M或LTF与NADH再生酶NOX共表达，全细胞催化10 mM混合CHD，180 min内10M专属产出S-HCH 72%产率、>99% ee；LTF专属产出R-HCH >99%产率、>99% ee。相比野生型“左右不分”的77%混合产率，突变体实现“左右互搏”向“单手制霸”的华丽转身，为抗抑郁药、抗心律失常药Vernakalant等手性药物中间体提供了即插即用的生物催化模块。
