《Advanced Science》：Inhibition of SLC11A1-Mediated Lysosomal Iron Accumulation in Microglia Promotes Repair Following White Matter Stroke
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本文聚焦脑白质卒中（WMS）后修复难题，首次揭示小胶质细胞溶酶体膜转运蛋白SLC11A1通过H+/Fe2+逆向转运导致溶酶体铁超载和酸化障碍，进而损害髓鞘碎片清除的关键机制。研究表明，利用拮抗剂LM22B-10或基因干预抑制SLC11A1可促进转录因子EB（TFEB）核转位及组织蛋白酶D（CTSD）表达，最终加速髓鞘再生和神经功能恢复，为WMS治疗提供了新靶点。
2.1 溶酶体通路与SLC11A1参与WMS的病理生理过程
脑白质卒中（WMS）是一种常见的脑血管疾病，占急性卒中的约25%，是导致痴呆的第二大原因。目前尚无促进WMS后恢复的有效疗法。本研究通过RNA测序分析发现，在WMS后的白质病变中，溶酶体通路被激活，且SLC11A1表达显著上调。免疫荧光和Western blotting结果证实，SLC11A1在小胶质细胞中的表达在卒中后呈时间依赖性增加，并在第7天达到峰值。比较不可修复的L-NIO模型和可修复的LPC模型发现，不可修复病变中SLC11A1的表达显著更高，表明SLC11A1在WMS的病理生理过程中起关键作用。
2.2 铁和髓鞘碎片在活化小胶质细胞溶酶体中沉积
在WMS背景下，富含胆固醇的髓鞘碎片在梗死核心区大量积累。免疫荧光显示，在L-NIO组中，活化小胶质细胞的溶酶体内有大量髓鞘碎片沉积，而LPC组中髓鞘积累极少。及时有效地清除髓鞘碎片对于从促炎环境向抗炎环境转变、促进少突胶质前体细胞（OPCs）分化为成熟少突胶质细胞（OLs）至关重要。研究发现，与铁代谢相关的蛋白（TFR1、FPN、FTH、FTL）、ACSL4、GPX4以及脂质过氧化产物4-HNE在WMS后随时间发生变化，其中FTH和FTL的表达在卒中后逐渐增加，在第7天达到峰值，这与SLC11A1的表达模式一致，表明白质病变中存在铁积累。
2.3 铁螯合增强溶酶体对髓鞘碎片的摄取和降解，促进受损白质恢复
鉴于活化小胶质细胞溶酶体中的铁积累与WMS后不可修复的白质病变相关，研究人员假设铁超载是WMS模型再髓鞘化失败的关键机制。使用铁螯合剂去铁胺（DFO）处理后，发现DFO减轻了L-NIO诱导的活化小胶质细胞溶酶体中的铁积累，降低了铁代谢相关蛋白（FTH、FTL、TFR1）和ROS相关标志物（4-HNE、ACSL4）的水平，同时增加了FPN和GPX4的水平。DFO治疗显著减少了胼胝体梗死体积，并在组织学和神经功能恢复方面表现更好。进一步实验表明，DFO处理增强了小胶质细胞对髓鞘碎片的溶酶体摄取和降解能力。
2.4 Slc11a1敲低促进WMS后白质修复
由于SLC11A1在WMS的病理生理过程中发挥时间依赖性作用，并参与溶酶体和细胞质之间的铁转运，研究人员假设敲低Slc11a1可促进白质恢复。通过立体定向注射Slc11a1-shRNA慢病毒载体，证实敲低Slc11a1可减少梗死体积，增加Caspr表达，改善神经功能，并增强小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬和降解能力。同时，Slc11a1敲低有效降低了溶酶体中FerroOrange的平均荧光强度，表明其通过减轻活化小胶质细胞内溶酶体的铁积累来促进白质恢复。
2.5 小胶质细胞特异性敲低Slc11a1通过抑制小胶质细胞铁沉积和增加核转录因子EB（TFEB）表达促进白质修复
为了确定小胶质细胞特异性敲低Slc11a1是否促进白质恢复，研究人员在Cx3cr1CreERT2小鼠中特异性降低Slc11a1表达。结果表明，小胶质细胞特异性敲低Slc11a1减小了梗死体积，增加了Caspr表达，改善了神经功能缺损，并增强了髓鞘碎片的清除能力。此外，Slc11a1敲低促进了少突胶质前体细胞（OPCs）向成熟少突胶质细胞（OLs）的分化。机制上，Slc11a1敲低减轻了溶酶体铁积累，并提高了TFEB的核质荧光比率，表明其促进了TFEB核转位。
2.6 Slc11a1过表达通过增加铁积累阻碍可修复LPC诱导脱髓鞘模型的白质恢复
为了研究Slc11a1过表达是否会破坏LPC模型的修复过程，研究人员构建了过表达Slc11a1的慢病毒载体。结果显示，Slc11a1过表达损害了病理修复，梗死体积显著增大，Caspr表达减少，神经功能恢复受损，髓鞘碎片清除延迟或受阻。同时，Slc11a1过表达加剧了铁积累，表明其通过增加铁积累阻碍了白质恢复。
2.7 单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示Slc11a1敲低的下游分子及相关细胞内信号通路
通过scRNA-seq分析，发现SLC11A1主要在小胶质细胞/巨噬细胞中表达，且敲低Slc11a1主要降低了小胶质细胞中SLC11A1的表达。将小胶质细胞进一步划分为8个亚群，其中簇5高表达与泡沫细胞分化、脂质储存、溶酶体功能、炎症反应调节和神经保护相关的基因。基因集变异分析（GSVA）显示，簇5中溶酶体酶分泌、胆固醇外流、晚期内体向溶酶体运输等通路被激活，而铁离子导入细胞通路被下调。在簇5内比较Slc11a1-shRNA处理组和对照组，发现与溶酶体腔酸化、晚期内体向溶酶体运输、溶酶体蛋白分解代谢相关的通路上调，而铁离子跨膜导入下调。差异表达基因（DEGs）分析表明，组织蛋白酶D（Ctsd）是Slc11a1敲低的一个潜在下游靶点。
2.8 小胶质细胞特异性过表达Ctsd促进缺血性白质损伤恢复
由于Ctsd被鉴定为Slc11a1的下游靶点，研究人员在Cx3cr1CreERT2小鼠中小胶质细胞特异性过表达Ctsd进行验证。结果显示，Ctsd过表达减少了梗死体积，增加了Caspr表达，改善了神经功能，并促进了髓鞘碎片的清除，表明确实能促进WMS恢复。
2.9 小胶质细胞特异性敲低Ctsd阻碍可修复LPC诱导脱髓鞘模型的白质恢复
相反，在LPC模型中特异性敲低小胶质细胞的Ctsd，则阻碍了病变的病理恢复，Caspr表达降低，神经功能受损，髓鞘碎片清除受阻，表明白质恢复失败。这进一步证实CTSD是SLC11A1的下游效应因子。
2.10 Slc11a1敲低通过减少铁积累和促进溶酶体酸化增强溶酶体髓鞘摄取和降解
体外实验表明，在原代小胶质细胞中敲低Slc11a1可增强其对PKH26标记髓鞘的摄取和降解能力。活细胞成像显示，敲低Slc11a1降低了溶酶体中的Fe2+水平，并提高了溶酶体的I540/I440比率，表明溶酶体酸化增强。同时，Slc11a1敲低显著增加了TFEB的核质荧光比率，促进了TFEB核转位。
2.11 通过分子动力学鉴定特异性SLC11A1拮抗剂及体外验证
基于SLC11A1的三维蛋白结构，通过虚拟筛选从化合物库中鉴定出LM22B-10作为潜在的SLC11A1拮抗剂。分子动力学模拟表明LM22B-10能与小鼠SLC11A1稳定结合。体外功能实验证实，LM22B-10处理以浓度依赖性方式（最佳浓度10 μM）增强溶酶体酸化，减少铁积累，并促进小胶质细胞对髓鞘的摄取。
2.12 LM22B-10促进缺血性白质恢复
体内实验表明，LM22B-10给药可减轻溶酶体铁积累，减小梗死体积，增加Caspr表达，改善神经功能，并增强髓鞘碎片的溶酶体摄取和降解，其效果与Slc11a1敲低相似，是一种潜在的治疗选择。
3 讨论
本研究首次证实SLC11A1作为小胶质细胞溶酶体膜上的H+/Fe2+逆向转运蛋白，在WMS后将Fe2+从细胞质转运至溶酶体，导致溶酶体铁超载和酸化障碍，进而损害髓鞘碎片清除能力。遗传或药理学抑制SLC11A1可减轻铁积累，促进溶酶体酸化及TFEB核转位，上调CTSD表达，最终增强髓鞘清除和再髓鞘化，促进白质修复和神经功能恢复。研究结果揭示了SLC11A1在WMS中的关键作用，并将其确立为促进卒中恢复的潜在治疗靶点。
