BNIP3L/NIX通过非线粒体自噬机制调控杏仁核谷氨酸能神经元线粒体分裂在情境恐惧记忆形成中的关键作用

《Advanced Science》：A Non-Mitophagy Activity of BNIP3L/NIX in Amygdala Glutamatergic Neurons is Essential for Contextual Fear Memory Formation

本文揭示了BNIP3L/NIX在杏仁核谷氨酸能神经元中不依赖其线粒体自噬活性的新功能。研究发现，BNIP3L通过竞争性结合AMPK，减少Drp1Ser637磷酸化，促进线粒体分裂，从而增强神经元兴奋性和突触传递，最终调控情境恐惧记忆的形成。这一发现为理解线粒体动力学在情绪记忆中的分子机制提供了新视角。

　　

2.1 Bnip3l^?/?小鼠表现出情境恐惧记忆形成障碍

为探究bnip3l在脑内的生理功能，研究人员首先检测了BNIP3L在成年小鼠脑内的表达情况。免疫染色结果显示，BNIP3L在多个脑区高表达，包括内侧前额叶皮层（mPFC）、丘脑室旁核（PVT）、基底外侧杏仁核（BLA）、中央杏仁核（CeA）和海马腹侧CA1区（vCA1）。这些脑区均与恐惧和负性情绪记忆编码密切相关。研究人员将bnip3l^?/?小鼠与其野生型（WT）同窝小鼠进行经典的情境恐惧条件化实验。实验发现，雄性bnip3l^?/?小鼠在训练和回忆阶段均表现出显著降低的僵直行为，表明其情境恐惧记忆受损。雌性bnip3l^?/?小鼠也表现出类似的记忆缺陷，提示BNIP3L调控恐惧记忆的机制不依赖于性别。进一步的行为学测试表明，bnip3l^?/?小鼠的运动协调能力、自发活动、痛觉敏感性、焦虑样和抑郁样行为均无显著改变，且其在社交行为、空间工作记忆、新物体识别和线索性恐惧记忆等测试中表现正常。这些结果说明bnip3l基因敲除选择性地损害了情境恐惧记忆，而非其他类型的学习记忆或基本行为功能。

2.2 BLA^GLU神经元中的BNIP3L对情境恐惧记忆形成至关重要

为确定导致恐惧记忆障碍的关键脑区，研究人员通过c-Fos免疫染色分析了恐惧条件化后BNIP3L富集脑区的神经元激活情况。结果显示，在经历5次足底电击后，WT小鼠的mPFC、PVT、BLA、CeA、dCA3和vCA1脑区的c-Fos⁺神经元数量显著增加。然而，bnip3l^?/?小鼠仅在BLA和vCA1脑区未能表现出相应的c-Fos⁺神经元增加。通过在vCA1^GLU神经元中特异性敲低BNIP3L，发现并不影响情境恐惧记忆。进一步分析BLA内的神经元类型发现，恐惧条件化主要激活的是谷氨酸能神经元，而非GABA能神经元，并且这种激活在bnip3l^?/?小鼠中被取消。研究人员随后利用病毒工具，分别在BLA的谷氨酸能神经元（BLA^GLU-shBNIP3L）和GABA能神经元（BLA^GABA-shBNIP3L）中特异性敲低BNIP3L。结果发现，BLA^GLU-shBNIP3L小鼠表现出与全身敲除小鼠相似的情境恐惧记忆缺陷，而BLA^GABA-shBNIP3L小鼠的记忆则未受影响。电生理记录显示，BLA^GLU-shBNIP3L神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的频率和振幅均显著降低，但其动作电位阈值、振幅、后超极化（AHP）和放电频率等内在特性无变化。这些数据强有力地表明，BLA谷氨酸能神经元中的BNIP3L对于情境恐惧记忆的形成至关重要。

2.3 线粒体自噬活性并非BNIP3L调控情境恐惧记忆所必需

BNIP3L作为线粒体自噬受体，其经典功能是介导线粒体清除。研究人员首先检测了足底电击是否会激活BLA脑区的线粒体自噬。然而，随着电击次数的增加，BLA组织中SQSTM1/p62、LC3和线粒体标志物TOMM20的蛋白水平均未发生改变，而阳性对照CCCP则能显著诱导LC3增加和SQSTM1、TOMM20的减少。进一步，通过在BLA^GLU神经元中敲低自噬关键基因atg7来抑制自噬，发现并不影响情境恐惧记忆的形成，提示自噬过程并非必需。BNIP3L通过其LC3相互作用区（LIR）与自噬体上的ATG8家族蛋白结合。研究人员构建了LIR缺失的BNIP3L突变体（BNIP3L^ΔLIR），该突变体丧失了介导线粒体自噬的能力。令人惊讶的是，在bnip3l^?/?小鼠的BLA^GLU神经元中过表达BNIP3L^WT或BNIP3L^ΔLIR，均能成功挽救其恐惧记忆缺陷。这些数据共同证明，BNIP3L在调控情境恐惧记忆的过程中，其功能不依赖于线粒体自噬活性。

2.4 Bnip3l缺失损害恐惧条件化后BLA^GLU神经元的线粒体分裂

线粒体形态动态变化对神经元功能至关重要。研究人员通过免疫染色和透射电镜（TEM）观察了恐惧条件化前后BLA神经元内线粒体的形态。在WT小鼠中，足底电击后BLA谷氨酸能神经元内的线粒体发生了显著的碎片化，表现为线粒体平均面积减小和圆形度增加。然而，在bnip3l^?/?小鼠中，这种电击诱导的线粒体形态变化被完全取消。TEM分析进一步证实，WT小鼠在经历5次电击后，BLA神经元内发生分裂的线粒体比例显著增加，而bnip3l^?/?小鼠则无此变化。相关性分析显示，每只小鼠的僵直行为持续时间与其BLA神经元的线粒体分裂事件呈正相关，与线粒体大小呈负相关。此外，通过Seahorse XF分析BLA组织的线粒体呼吸功能，发现恐惧条件化后的WT小鼠线粒体耗氧率、基础呼吸、最大呼吸、ATP产量和呼吸储备能力均有所提升，而这些改善效应在bnip3l^?/?小鼠中消失。这些结果表明，BNIP3L是恐惧条件化诱导BLA^GLU神经元线粒体分裂和呼吸功能增强所必需的。

2.5 BLA神经元线粒体分裂对情境恐惧记忆形成至关重要

研究人员进一步探究了线粒体分裂本身是否在恐惧记忆中发挥作用。TEM分析显示，WT小鼠BLA神经元的线粒体分裂事件随着电击次数的增加而增多，但在条件化结束2小时后恢复，表明这是一种短暂的生理性重塑而非病理性碎片化。约95%的分裂发生在线粒体中段（midzone fission），这种分裂方式有助于增加ATP产量而不影响钙缓冲能力。利用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1抑制Drp1活性，发现其能降低Drp1^Ser616的磷酸化，并显著损害情境恐惧记忆的形成。同时，Mdivi-1处理也降低了BLA神经元的sEPSC频率和振幅，并削弱了线粒体呼吸功能。这些发现说明，由BNIP3L驱动的、Drp1介导的线粒体中段分裂，对于满足神经元能量需求、维持突触传递和恐惧记忆形成至关重要。

2.6 光驱动BLA线粒体分裂可挽救Bnip3l^?/?小鼠的恐惧记忆缺陷

为验证增强线粒体分裂是否能挽救bnip3l^?/?小鼠的表型，研究人员采用了光遗传学技术。他们构建了光诱导的Drp1寡聚化系统，将Drp1与拟南芥隐花色素2（Drp1-Cry2）或其相互作用蛋白CIB1（Drp1-CIB1）融合。当蓝光（465 nm）照射时，Drp1-Cry2和Drp1-CIB1发生异源二聚化，从而诱导线粒体分裂。在bnip3l^?/?和WT小鼠的BLA^GLU神经元中表达该系统，并在恐惧条件化前30分钟给予蓝光照射。结果显示，光诱导的线粒体分裂能够显著挽救bnip3l^?/?小鼠的情境恐惧记忆缺陷。电生理记录进一步证实，光驱动分裂恢复了bnip3l^?/?小鼠BLA^GLU神经元中降低的sEPSC频率。该实验证明，BNIP3L位于线粒体分裂的上游，其驱动的分裂事件是维持神经元兴奋性和恐惧记忆所必需的。

2.7 BNIP3L驱动BLA^GLU神经元中Drp1依赖的线粒体分裂

Drp1是介导线粒体分裂的关键GTP酶。研究人员通过免疫染色发现，恐惧条件化后，WT小鼠BLA神经元线粒体上的Drp1斑点数量和大小均显著增加，而在bnip3l^?/?小鼠中这一效应被取消。通过生化方法分离BLA组织的线粒体组分和胞质组分，证实恐惧条件化后WT小鼠线粒体上的Drp1蛋白量增加，而bnip3l缺失则阻断了这一增加。这些结果共同表明，BNIP3L促进了恐惧条件化过程中Drp1向线粒体的募集，从而驱动线粒体分裂。

2.8 BNIP3L通过竞争性结合AMPK降低Drp1^Ser637磷酸化

Drp1的活性受磷酸化调控：Ser616位点磷酸化（p-Drp1^Ser616）促进分裂，而Ser637位点磷酸化（p-Drp1^Ser637）抑制分裂。研究发现，bnip3l缺失取消了恐惧条件化引起的BLA组织中p-Drp1^Ser616增加和p-Drp1^Ser637减少。进一步分析发现，恐惧条件化后，AMPK（而非Cdk1）向线粒体的定位显著增加，且该增加依赖于BNIP3L。使用AMPK激动剂AICAR处理，可取消恐惧条件化导致的Drp1^Ser637磷酸化降低。邻近连接技术（PLA）检测显示，在bnip3l^?/?小鼠BLA中，Drp1与AMPK的相互作用在恐惧条件化后显著增强。免疫共沉淀实验证实，外源表达的BNIP3L能与AMPK直接结合。此外，PLA实验发现恐惧条件化后WT小鼠BLA中BNIP3L与AMPK的相互作用增强。这些结果表明，BNIP3L通过竞争性地与AMPK结合，减少了AMPK对Drp1^Ser637的磷酸化，从而解除了对Drp1活性的抑制，促进了线粒体分裂。

3 讨论

本研究揭示了BNIP3L在成年大脑中一个不依赖于线粒体自噬的新功能。研究发现，BNIP3L在BLA谷氨酸能神经元中高表达，并通过调控Drp1依赖的线粒体分裂，在情境恐惧记忆形成中发挥关键作用。在恐惧条件化这一急性应激下，BNIP3L被招募来调节AMPK-Drp1信号轴，促进线粒体中段分裂，从而增加ATP供应，满足神经元兴奋和突触传递的能量需求。这种作用具有细胞类型特异性，因为敲低BLA GABA能神经元中的BNIP3L并不影响恐惧记忆。本研究将BNIP3L的功能从线粒体质量控制的“清道夫”扩展到了神经元能量代谢和可塑性的“调节器”，为理解线粒体动力学在情绪学习记忆中的精细调控提供了新的分子框架，也为相关精神疾病的机制研究和治疗策略开发提供了新的视角。