肿瘤微环境激活的Cu2-xS/LDH纳米探针原位合成及其在光声成像引导结直肠癌放疗中的应用

《Advanced Science》：In Situ Synthesis of a Tumor Microenvironment-Activated Radiosensitizing Cu2-xS/LDH Probe for Photoacoustic Imaging-Guided Radiotherapy

本文报道了一种新型有机-无机杂化纳米探针CAL-IR，它通过在肿瘤微环境（TME）中响应内源性H2S原位生成Cu2-xS纳米粒子，实现了近红外一区（NIR-I）和近红外二区（NIR-II）双窗口光声成像（PAI）信号激活，并通过消耗H2S、增强X射线衰减和自身放射增敏作用，显著提高了结直肠癌的放疗疗效。该探针兼具精准诊断和高效治疗功能，为肿瘤诊疗一体化提供了新策略。

　　

引言

结直肠癌是全球最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的第二大原因，对人类健康构成重大威胁。氢硫化氢（H₂S）是一种重要的气体信号分子，在结直肠癌组织中，由于胱硫醚β-合成酶（CBS）和胱硫醚γ-裂解酶（CSE）的高表达，导致H₂S大量产生（浓度范围为0.3-3.4 mM），参与肿瘤的进展和转移。这种高浓度的内源性H₂S构成了结直肠癌独特的肿瘤微环境（TME），使其成为精确诊断和治疗的潜在靶点。

光声成像（PAI）结合了高空间分辨率、高灵敏度、无创性、实时成像和深层组织穿透等优点，成为一种有前景的生物医学成像技术。然而，大多数PA对比剂是“始终开启”型，存在信噪比低、特异性差的问题，容易导致诊断错误。可激活的PA对比剂能够特异性响应病变组织病理微环境中的生物标志物，有助于降低背景信号，提高信噪比，减少假阳性诊断的风险。因此，设计和构建可激活的PA成像对比剂是当前研究的主要趋势之一。

放疗因其组织穿透深度不受限制的特性而具有独特的治疗优势。研究人员已经探索并开发了一系列物理、化学和生物学方法来改变和调节肿瘤细胞对辐射的敏感性。多功能纳米探针作为放射增敏剂或剂量增强剂，可用于提高恶性组织对放疗的反应性。例如，高原子序数的贵金属纳米颗粒（如金、银、钆）因其高光吸收截面能有效沉积X射线能量。此外，半导体材料（如二氧化钛TiO₂、氧化锌ZnO）以及某些过渡金属硫族化物（如二硫化钨WS₂、硒化铋Bi₂Se₃、硫化铋Bi₂S₃、硫化铜CuS、硫化铜铋Cu₃BiS₃）也显示出作为放射增敏剂的潜力。然而，放疗过程中产生的活性氧（ROS）会被TME中高水平的还原性物质（如谷胱甘肽和H₂S）清除，从而降低放疗对癌细胞的细胞毒性作用。引入能够吸收和清除癌细胞内核源性还原物质的纳米探针可以改变TME，从而增强放疗的放射增敏效果并抑制肿瘤细胞的修复机制。

基于上述因素，本研究开发了一种新型的TME响应性PA成像纳米探针，用于结肠癌组织成像和改善X射线放射增敏治疗。

CAL-IR的合成与表征

本研究首先通过共沉淀法制备了铜基层状双氢氧化物（Cu-LDH）纳米片作为前体。然后，通过离子交换将近红外有机染料IR-806嵌入Cu-LDH层间，并利用羧基化聚乙二醇（COOH-PEG）进行表面修饰以增强生物相容性，最终得到名为CAL-IR的纳米探针。

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像证实了CAL-IR的层状结构，平均尺寸约为150纳米。元素面扫描（EDS）和X射线光电子能谱（XPS）分析确认了Cu、Al等元素的存在，证明了Cu-LDH前体的成功合成。负载IR-806后，CAL-IR的XPS谱图与Cu-LDH基本一致。紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸收光谱显示，前体Cu-LDH在近红外区域（尤其是NIR-II区）吸收很弱。IR-806的最大吸收峰在800纳米附近。有趣的是，当IR-806负载到二维Cu-LDH纳米片上后，其最大吸收峰位置发生了显著变化，出现了在925纳米的宽红移吸收带（对应于J型聚集）和在760纳米的蓝移吸收带（对应于H型聚集的面对面π-π堆积）。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和X射线衍射（XRD）图谱进一步证实了IR-806的成功负载以及LDH层状结构的保持。动态光散射（DLS）结果显示，经过IR-806嵌入和PEG修饰后，CAL-IR的水合粒径减小，Zeta电位从Cu-LDH前体的+38.4 mV降至+19.6 mV，表明成功的嵌入和修饰。

纳米探针CAL-IR对H₂S的体外响应

为了研究纳米探针的响应性能，选择Na₂S作为H₂S的前体，与CAL-IR复合纳米探针反应生成Cu_2-xS/CAL-IR。TEM图像显示，与H₂S反应后，纳米片上生长出大量球形颗粒，且随着反应时间和Na₂S浓度的增加，球形颗粒数量呈上升趋势。

稳定性测试表明，IR-806水溶液在储存10小时后最大吸收峰强度下降近70%，稳定性较差。而嵌入LDH层间的CAL-IR水分散样品，即使在室温下储存20天，其吸收强度也基本保持不变，证明了层状结构对小分子染料的保护和稳定作用。

UV-vis吸收光谱显示了CAL-IR探针与不同浓度Na₂S（0–3.0 mM）孵育后，在NIR-I和NIR-II窗口吸收强度的变化。在NIR-II窗口1250纳米处的吸收随着H₂S（Na₂S）浓度的增加而逐渐增强，这是由于CAL-IR层上的Cu²⁺与S^2?离子反应生成Cu_2-xS量子点所致。同时，Cu_2-xS量子点异质结的形成影响了Cu-LDH层的微观结构和电荷性质，导致层间小分子重新排列。原本的H型聚集（蓝移至760纳米）和J型聚集（红移至925纳米）转变为无定形排列，使得835纳米处的吸收峰逐渐增强。与其他信号分子相比，只有H₂S能显著诱导1250纳米处吸光度的变化，表明CAL-IR具有优异的选择性和特异性。

随后的光声性能研究表明，在835纳米和1250纳米波长处，CAL-IR的PA信号强度与H₂S浓度呈正相关，这与吸收度的变化趋势一致。这些结果成功地在体外构建了一种基于H₂S响应、“双波长开启”策略的PA成像纳米探针。

CAL-IR纳米颗粒在CT26细胞中的体外PA成像和治疗效果

在进入体内实验前，首先评估了CAL-IR复合纳米探针在结直肠癌细胞CT26中的H₂S响应性PA成像信号变化及其在X射线放疗中的性能。细胞毒性实验表明，CAL-IR探针对正常人肝细胞L02具有很高的生物相容性。对CT26细胞，在80 μg/mL浓度下细胞存活率仍高于80%，但随浓度增加有轻微下降，表明较高浓度的材料对CT26细胞有轻微毒性。

将细胞分为四组（I: PBS组；II: CAL-IR组；III: CAL-IR + ZnCl₂组；IV: CAL-IR + L-半胱氨酸L-Cys组）进行不同处理（L-Cys作为细胞内H₂S的增强剂，ZnCl₂作为抑制剂），然后收集细胞进行PA成像。结果显示，只有PBS对照组没有明显的PA信号。与探针孵育的组别在835和1250纳米波长处均显示出显著的PA信号。在用ZnCl₂抑制部分细胞内H_2</subS的组别中，两个波长处的PA信号较单纯探针组略有减弱。而在用H₂S增强剂L-Cys处理的组别中，由于细胞内H₂S水平升高，PA信号相较于探针组显著增强。这证明了CAL-IR复合纳米探针能够被细胞内不同浓度的H₂S激活，同时开启NIR-I窗口（835纳米）和NIR-II窗口（1250纳米）的PA信号，具备优异的细胞内可激活PA成像能力。

在80 μg/mL的CAL-IR浓度下，研究了不同剂量X射线对CT26细胞死亡的影响。细胞存活率随X射线辐射剂量的增加而逐渐降低，证实了CAL-IR对癌细胞的放射增敏作用。在4 Gy剂量下实现了50%的杀伤率，因此选择该剂量进行后续实验。

CAL-IR探针在细胞内积累后生成的Cu_2-xS是一种过渡金属硫化物半导体材料，对癌细胞具有放射增敏作用。同时，细胞内H₂S被清除，破坏了TME中的氧化还原平衡，抑制了癌细胞的修复能力，并且放疗产生的ROS不会被H₂S中和，从而改变了TME，增强了细胞对放疗的敏感性，导致更多ROS在肿瘤细胞内积累。共聚焦荧光显微镜图像和荧光强度定量分析表明，CAL-IR+X射线实验组显示出显著的ROS积累（绿色荧光更强）。流式细胞术细胞凋亡分析显示，CAL-IR+X射线实验组的总凋亡率（Q2 + Q3）为37.72%，显著高于单独X射线组和单独CAL-IR组。钙黄绿素AM（Calcein AM）和碘化丙啶（PI）双染色实验也证实了CAL-IR在X射线放疗诱导下对CT26结肠癌细胞具有优异的细胞毒性。共同使用CAL-IR（80 μg/mL）和Na₂S（1 mM）会减缓细胞存活率的下降速度，添加Na₂S减弱了CAL-IR对癌细胞的放射增敏作用，证明清除H₂S是放射增敏的关键机制之一。

皮下肿瘤体内NIR-I和NIR-II PA成像

体外实验证实CAL-IR具有H₂S激活的PA成像特性后，进一步在小鼠皮下肿瘤模型上评估了其体内成像能力。结果显示，经此纳米探针处理的肿瘤在835和1250纳米处均发出显著的PA信号，信号强度在15小时达到峰值，并在24小时时仍可检测到。这表明CAL-IR纳米探针能有效富集于肿瘤并具有较长的滞留时间。更重要的是，探针对肿瘤内源性H₂S产生响应，成功实现了NIR-I和NIR-II双波长PA成像，实现了对肿瘤的可视化实时监测，为肿瘤成像和治疗指导提供了重要依据。

CAL-IR对结肠癌的体内放疗效果

通过在CT26荷瘤小鼠上进行抗肿瘤实验，进一步证实了CAL-IR纳米探针的体内响应性和放疗效果。小鼠被随机分为四组：PBS对照组、X射线单独照射组、CAL-IR探针单独注射组、CAL-IR+X射线联合治疗组。结果表明，PBS对照组肿瘤生长迅速，体积超过初始五倍。X射线组和CAL-IR组的肿瘤体积增长较慢，可能与X射线或探针自身的细胞毒性作用有关。而CAL-IR+X射线实验组在治疗后肿瘤体积显著减小。这种效果可能归因于CAL-IR与结肠癌组织中的H₂S发生原位反应，形成Cu_2-xS异质结构，增强了X射线衰减，从而提高了放疗效果。同时，TME中H₂S的消耗也增强了联合治疗的效果。实验期间小鼠体重保持相对稳定，表明治疗的安全性和有效性。治疗后收集的肿瘤组织进行苏木精-伊红（H&E）染色显示，CAL-IR+X射线组肿瘤细胞损伤最为严重，核固缩、溶解现象明显，表明该治疗对癌细胞产生了显著的细胞毒性作用。

生物安全性评估

CAL-IR的生物相容性通过溶血分析进行评估，结果显示即使在80 μg/mL浓度下，CAL-IR也具有良好的血液相容性，溶血率低于10%。血液生化分析表明，X射线+CAL-IR治疗组小鼠的肝肾功能指标和血液学指标均在正常范围内，未观察到明显的毒副作用或免疫反应。此外，对不同治疗组小鼠主要器官的H&E染色分析未发现显著损伤，这证实了CAL-IR增敏下的放疗具有生物安全性。

结论

本研究成功开发了一种新型有机-无机纳米复合材料CAL-IR，通过将有机染料IR-806嵌入Cu-LDH中，实现了肿瘤激活的近红外PA成像和放射增敏性能。该探针应用于结直肠癌的响应性PA成像引导的X射线放疗。它能特异性响应癌细胞中高浓度的H₂S，原位生成硫化铜（Cu_2-xS）纳米粒子，激活NIR-I和NIR-II双窗口PA信号。Cu_2-xS的原位形成， coupled with H₂S的消耗，使CAL-IR成为一种有效的放射增敏剂。体外和体内实验均证明，这种纳米药物具有强大的抗肿瘤效果和较低的系统毒性。CAL-IR作为一种有效的诊疗一体化制剂，其H₂S响应性双PA成像能够以最小的假阳性准确检测结直肠病变，而其强大的放射增敏特性显著增强了X射线治疗的抗肿瘤效果。因此，本研究为结直肠癌的精确诊断和X射线放疗的增强提供了一种新方法。