治疗性低温通过增强类淋巴-脑膜淋巴-深颈淋巴系统引流缓解脑室出血后脑积水和神经功能障碍

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Therapeutic Hypothermia Alleviates Hydrocephalus and Neurological Dysfunction Post Intraventricular Hemorrhage by Enhancing Drainage of Glymphatic-Meningeal Lymphatic-Deep Cervical Lymphatic System

本文系统探讨了治疗性低温（TH）通过调控RTN3/AMPK/ERS通路增强类淋巴（GS）-脑膜淋巴（mLVs）-深颈淋巴（dCLNs）系统引流功能，从而改善脑室出血（IVH）后脑积水和神经功能障碍的作用机制。研究结合动物模型和细胞实验证实，TH能恢复AQP4极性分布、改善脑脊液（CSF）动态平衡，为IVH后继发性脑积水的非手术治疗提供了新靶点。

　　

1 引言

脑室出血（IVH）作为临床危急重症，具有高致死率和高致残率特点，常继发脑积水和神经功能障碍。脑积水定义为脑脊液（CSF）在脑室系统中的异常积聚，其本质是CSF动力学稳态失衡。近年来研究发现，类淋巴系统（GS）-脑膜淋巴系统（mLVs）-深颈淋巴系统（dCLNs）构成的多级引流轴在CSF代谢中发挥关键作用。GS作为2012年发现的脑内类淋巴循环网络，存在于血管周围间隙（PVS），通过星形胶质细胞终足上的水通道蛋白4（AQP4）介导CSF与组织液交换。随后代谢废物通过mLVs引流至dCLNs，最终进入体循环。

治疗性低温（TH）作为神经保护辅助手段，通过诱导冷应激反应（控制核心温度33°C±1°C）降低细胞代谢率，已被应用于创伤性脑损伤（TBI）、蛛网膜下腔出血等疾病的治疗。分子机制研究表明，冷应激可上调内质网定位蛋白网状蛋白3（RTN3），激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，并抑制内质网应激（ERS）。这些信号分子与GS功能调节存在潜在关联，提示RTN3/AMPK/ERS通路可能介导TH对淋巴引流的调控作用。

2 方法

研究采用雄性SD大鼠建立IVH模型（通过侧脑室注射自体血），设立假手术组、IVH组、IVH+TH组、IVH+TH+dCLNs结扎组和IVH+TH+AMPK抑制剂（Dorsomorphin）组。TH干预在IVH后实施，维持直肠温度33°C±1°C持续6小时。通过MRI T₂成像评估脑室体积，T₁加权成像观察钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）在脑实质渗透性。采用免疫荧光（IF）检测AQP4极化分布（通过GFAP/CD31与AQP4共定位分析），Western blot（WB）检测RTN3、p-AMPK、ERS标志物（ATF4、CHOP、p-eIF2α）表达。细胞实验采用大鼠星形胶质细胞和小鼠淋巴管内皮细胞，通过流式细胞术评估凋亡，IF检测细胞功能蛋白表达。

3 结果

3.1 TH改善IVH后神经功能缺损

行为学测试显示IVH组大鼠改良神经功能缺损评分（mNSS）显著升高，转角试验和圆筒试验呈现明显肢体不对称性。TH干预后神经功能明显改善，而dCLNs结扎或AMPK抑制剂可逆转该保护作用。旷场实验（OFT）和新物体识别（NOR）实验表明TH能缓解IVH诱导的焦虑样行为和认知障碍，Morris水迷宫（MWM）证实TH改善空间学习记忆能力。

3.2 TH减轻脑积水和病理损伤

MRI显示IVH组脑室明显扩张，TH干预后脑室体积缩小。HE染色发现IVH组室管膜纤毛脱落、脉络丛炎性细胞浸润，TH可改善上述病理改变。尼氏染色显示TH减少海马区神经元凋亡，免疫荧光检测发现TH抑制星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba-1）活化，减轻神经炎症。FJC和TUNEL染色证实TH减少神经元退行性变和晚期凋亡。

3.3 TH恢复类淋巴系统功能

Gd-DTPA的MRI T₁成像显示IVH组对比剂脑实质渗透性显著降低，TH干预后渗透性增强。荧光示踪实验（RITC-Dextran 70 kD）发现TH促进CSF向脑实质流入（influx）和脑实质代谢废物向CSF清除（efflux）。WB检测表明TH增强髓鞘碱性蛋白（MBP）和磷酸化Tau（pTau）的清除，该作用被dCLNs结扎或AMPK抑制剂阻断。

3.4 TH维持类淋巴系统结构完整性

透射电镜（TEM）显示IVH组神经血管单元（NVU）结构破坏，血管周围间隙（PVS）扩张，星形胶质细胞终足水肿。IF检测发现IVH导致AQP4去极化（极化指数降低），TH干预后AQP4重分布于血管周隙。WB进一步证实TH提高AQP4 M23/M1亚型比值，恢复AQP4极性。

3.5 TH激活RTN3/AMPK/ERS通路

WB检测显示TH上调RTN3表达，促进AMPK磷酸化（p-AMPK/AMPK比值升高），并降低ERS标志物ATF4、CHOP和p-eIF2α水平。dCLNs结扎或AMPK抑制剂可逆转TH对上述分子的调控作用。

3.6 TH改善脑膜淋巴系统功能与结构

IF染色显示IVH组mLVs分支数量和总长度减少，TH干预后Lyve-1阳性面积和VEGFC表达增加。mLVs光消融实验证实破坏mLVs可逆转TH对脑积水的改善作用，验证mLVs在TH保护机制中的关键地位。

3.7 TH促进深颈淋巴引流

荧光示踪显示TH增加dCLNs中RITC-Dextran蓄积量。HE染色发现TH改善dCLNs组织结构紊乱，IF检测显示TH提高Lyve-1与Ki-67共定位系数，促进淋巴管增殖。

3.8 TH直接抑制细胞ERS

细胞实验表明TH降低星形胶质细胞和淋巴管内皮细胞凋亡率，上调AQP4、Lyve-1、VEGFC表达，并抑制ERS相关蛋白表达。AMPK抑制剂可拮抗TH的细胞保护作用。

4 讨论

本研究首次系统阐明TH通过增强GS-mLVs-dCLNs系统引流功能缓解IVH后脑积水的机制。TH通过冷应激反应激活RTN3/AMPK/ERS通路，改善AQP4极化分布，促进CSF代谢废物清除，最终恢复神经功能。研究局限性在于未建立多细胞共培养模型模拟淋巴引流网络，且缺乏RTN3基因敲除实验验证因果关联。未来需通过临床回顾性研究和随机对照试验推动TH的临床转化。

5 结论

TH通过调控RTN3/AMPK/ERS通路增强类淋巴-脑膜淋巴-深颈淋巴系统引流功能，有效缓解IVH后脑积水和神经功能障碍，为IVH的非手术治疗提供了新策略。