《Journal of Neuroimmunology》：The NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924 reduces inflammation, blood-brain barrier disruption and brain injury after intracerebral hemorrhage in mice
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脑出血后炎症反应通过NEDD8通路介导，MLN4924抑制该通路减轻血脑屏障破坏及神经损伤，机制涉及p-ERK5-KLF2-ICAM-1轴。
余黄|王志涵|王少晨|刘晨曦|常璐萍|耿雪|杜鹏月|王永辰|范文英|赵炳桥
中国复旦大学脑科学研究院，国家脑功能与疾病重点实验室及教育部脑科学前沿中心，上海200032
摘要
炎症是导致脑出血（ICH）后继发性脑损伤的关键因素。Neddylation是一种翻译后修饰过程，它将NEDD8（神经元前体细胞特异性发育下调蛋白8）连接到目标蛋白上，从而调控多种细胞过程。Neddylation在多种癌症中过度激活，并与动脉粥样硬化和炎症性疾病有关，但其在中风中的作用仍不明确。在本研究中，通过注射胶原酶诱导小鼠发生脑出血。随后通过皮下注射NEDD8激活酶抑制剂MLN4924进行治疗。我们发现脑出血后巨噬细胞和小胶质细胞中的NEDD8表达上调。MLN4924处理可降低NEDD8表达、cullin-1的Neddylation水平、巨噬细胞浸润、小胶质细胞活化以及促炎细胞因子的产生。这些抗炎作用表现为紧密连接蛋白的损失减轻、血脑屏障（BBB）损伤减轻、神经元退化减缓以及脑损伤改善。此外，MLN4924处理还促进了cullin-RING E3连接酶底物的积累（包括磷酸化的ERK5和KLF2），并降低了ICAM-1的表达。抑制ERK5可逆转MLN4924对炎症、BBB破坏和神经行为缺陷的积极作用。总体而言，MLN4924通过p-ERK5-KLF2-ICAM-1轴抑制NEDD8通路，从而减轻炎症、BBB破坏和神经功能缺陷，表明NEDD8通路可能是治疗脑出血的潜在靶点。
引言
自发性脑出血（ICH）是一种中风亚型，具有较高的死亡率和致残率（Collaborators, 2021）。早期抗凝逆转和微创血肿清除技术在人类试验中显示出改善的功能结果（Pradilla et al., 2024; Sheth et al., 2024）。然而，神经保护剂在脑出血患者中的治疗潜力尚未得到证实。炎症被认为是脑出血后继发性脑损伤的关键机制，对严重的神经后果有显著影响（Loan et al., 2022）。脑出血后的炎症反应表现为小胶质细胞活化以及中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞渗入出血脑组织（Wang and Dore, 2007）。这些炎症细胞通过释放炎症介质和促炎细胞因子加剧血脑屏障（BBB）破坏和神经元损伤（Zhu et al., 2019）。因此，更好地理解脑出血后的炎症机制对于发现新的治疗靶点至关重要。
Neddylation是一种翻译后修饰过程，它将神经元前体细胞特异性发育下调蛋白8（NEDD8，一种类泛素蛋白）连接到目标蛋白上（Kamitani et al., 1997）。这一过程涉及由NEDD8激活酶E1、NEDD8结合酶E2和NEDD8 E3连接酶催化的一系列酶促级联反应（Enchev et al., 2015）。NEDD8最著名的底物是cullins，它们是cullin-RING E3连接酶（CRL）复合体的关键组成部分（Duda et al., 2008）。NEDD8与cullins的保守赖氨酸结合后，可激活CRLs，使其能够泛素化多种蛋白质并调控关键细胞过程，如细胞生长、DNA复制和凋亡（Zhao et al., 2014）。先前的研究表明，在多种疾病（包括癌症、动脉粥样硬化、创伤性脑损伤和阿尔茨海默病、帕金森病、路易体痴呆等神经退行性疾病）中存在NEDD8异常积累和定位异常（Asare et al., 2017; Balasubramaniam et al., 2019; Chen et al., 2012; Choo et al., 2012; Mori et al., 2005; Yu et al., 2018; Zhang et al., 2024; Zhang et al., 2025），并且NEDD8参与炎症损伤（Zhu et al., 2017）。此外，作为NEDD8激活酶的小分子抑制剂MLN4924已被证明能抑制肿瘤细胞侵袭、减轻炎症并抑制动脉粥样硬化斑块的形成（Asare et al., 2017; Hao et al., 2019; Soucy et al., 2009）。由于其特定的抗癌作用，MLN4924已在多发性骨髓瘤（临床试验编号：NCT00722488）和其他恶性肿瘤（临床试验编号：NCT00677170）的临床试验中进行了评估（Sarantopoulos et al., 2016; Shah et al., 2016）。
我们之前报告过Neddylation在调节脑缺血中的重要作用（Yu et al., 2022），但其在中风中的作用尚未明确。在本研究中，利用脑出血小鼠模型发现脑出血后巨噬细胞和小胶质细胞中的NEDD8被激活。此外，我们证明MLN4924可减轻炎症损伤和BBB破坏，并改善神经功能缺陷，这种保护作用可能通过磷酸化 extracellular signal-regulated kinase 5（p-ERK5）/krüppel-like factor 2（KLF2）/intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）信号通路介导。
实验动物
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）和ARRIVE指南进行，并获得了复旦大学脑科学研究院动物护理和使用委员会的批准（2018 IOBS JS-025）。实验所用雄性野生型（WT）C57BL/6小鼠，年龄10–12周，购自SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.（上海），并饲养在复旦大学的动物设施中。动物在标准条件下饲养，温度受控。
NEDD8在脑出血损伤中的表达
为了研究Neddylation是否参与脑出血的进展，我们对小鼠进行了脑出血处理，并在24小时后检测了出血周围区域的NEDD8表达（图1A）。与假手术对照组相比，NEDD8表达显著增加（图1B-C，4.6 ± 4.0 vs 110.6 ± 18.5，n = 6，P < 0.0001）。双重免疫染色显示NEDD8主要与巨噬细胞共定位（图1D）。小胶质细胞也表达NEDD8（图1E），但表达量较少。
讨论
本研究表明，脑出血后出血周围区域的巨噬细胞和小胶质细胞中NEDD8蛋白表达上调。NEDD8激活酶抑制剂MLN4924抑制Neddylation后，神经元退化和出血性脑损伤得到减轻。这些保护作用与脑出血引起的巨噬细胞浸润、小胶质细胞活化、促炎细胞因子产生减少以及BBB完整性保持有关。
作者贡献声明
余黄：撰写初稿、数据可视化、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。
王志涵：实验实施、数据管理。
王少晨：实验实施、数据管理。
刘晨曦：实验实施、数据管理。
常璐萍：方法设计。
耿雪：实验实施。
杜鹏月：概念构思。
王永辰：数据分析。
范文英：撰写、审稿与编辑、监督、方法设计、资金争取。
出版同意
所有作者均已阅读并同意最终发表的手稿版本。
伦理批准
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）和ARRIVE指南进行，并获得了复旦大学脑科学研究院动物护理和使用委员会的批准（2018 IOBS JS-025）。
资金来源
本工作得到了中国国家自然科学基金（31872777）、上海市科技重大专项（项目编号2018SHZDZX01）、ZJ实验室以及上海脑科学与脑启发技术中心的资助。
利益冲突声明
作者声明在本研究中不存在潜在的利益冲突。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（31872777）、上海市科技重大专项（项目编号2018SHZDZX01）、ZJ实验室以及上海脑科学与脑启发技术的资助。
