KCTD16调控GABAB受体介导的抑制性通路在疼痛调控中的关键作用

《Neurobiology of Disease》：The role of auxiliary GABAB receptor subunit KCTD16 in pain modulation

本研究针对慢性疼痛治疗中GABAB受体信号通路调控机制不明确的难题，通过系统性研究揭示了辅助亚基KCTD16在脊髓背角痛觉传递中的核心作用。研究人员发现KCTD16缺失会显著减弱巴氯芬的镇痛效果，并破坏抑制性突触传递的平衡，表明GABAB受体-KCTD16复合物是治疗慢性疼痛的潜在新靶点。

　　

慢性疼痛影响着全球近10%的人口，由于现有疗法的疗效有限和不良反应，它仍然是一个重大的临床挑战。在疼痛处理过程中，脊髓背角内兴奋性和抑制性突触传递的精确平衡至关重要，其中γ-氨基丁酸（GABA）能抑制系统扮演着主导角色。特别是代谢型GABA_B受体（GABA_BR），它通过缓慢的调制通路对于维持兴奋-抑制平衡至关重要。然而，GABA_B受体的功能受到其辅助亚基的精细调控，其中钾通道四聚化域（KCTD）蛋白家族成员是关键。尽管KCTD16在前脑回路中已被广泛研究，但它在脊髓疼痛处理中的作用仍未被探索。

为了解决这一知识空白，由Daniel Vasconcelos、Mario Heles、Pavel Adamek、Anirban Bhattacharyya、Adolf Melichar、Rostislav Turecek和Jiri Palecek组成的研究团队在《Neurobiology of Disease》上发表了他们的研究成果。他们提出假设，认为KCTD16是痛觉通路中GABA_B受体介导的调制的关键结构和功能决定因素。具体来说，KCTD16可能协调突触前GABA_B受体与其下游效应通道，以调节背角中的神经递质释放，而KCTD16的缺失会削弱抑制性GABA_B受体信号传导，导致异常的痛觉处理和巴氯芬反应性降低。

为了验证这一假设，研究人员进行了一系列实验。他们采用了免疫组织化学分析、脊髓切片全细胞膜片钳记录、背根神经节（DRG）神经元钙成像以及野生型（WT）和KCTD16基因敲除（KCTD16^-/-）小鼠的行为学测试等关键技术方法。研究使用了成年雄性和雌性KCTD16^-/-小鼠（BALB/c背景），并重点关注KCTD16^-/-及其WT同窝小鼠。行为学、药理学、免疫组织化学、膜片钳电生理学和钙成像研究均使用雄性WT和KCTD16^-/-同窝小鼠以保持一致性。还使用了角叉菜胶诱导的周围炎症模型。

KCTD16在脊髓背角浅层和DRG中高表达

免疫组织化学分析显示，KCTD16免疫反应性集中在背角的浅层（I-II层），并沿腹内侧轴逐渐减少。在背根神经节中，几乎所有神经元都被标记，染色强度与胞体大小成反比：小神经元表现出强的免疫阳性，而较大的神经元标记较弱。

在基础条件下，KCTD16缺失降低mIPSC频率及其GABA_B介导的抑制

记录微型抑制性突触后电流（mIPSC）显示，WT细胞的mIPSC频率显著高于KCTD16^-/-细胞。巴氯芬应用显著降低了WT神经元中的mIPSC频率，但在KCTD16^-/-细胞中，频率降低不显著。事件间隔累积频率分析显示，巴氯芬应用后WT细胞显著右移，但KCTD16^-/-细胞中的效应减弱。未观察到mIPSC振幅的显著差异。

巴氯芬在WT中降低leIPSC振幅，但在KCTD16^-/-小鼠中无此效应

通过光脉冲在背角浅层兴奋性神经元中诱导出光诱发抑制性突触后电流（leIPSC）。WT小鼠的神经元表现出比KCTD16^-/-同窝小鼠更大的leIPSC振幅。巴氯芬应用使WT神经元的leIPSC振幅降低60.8%，而KCTD16^-/-神经元仅降低28.6%，且不显著。冲洗后，WT神经元的leIPSC仍相对于基线被抑制，而KCTD16^-/-细胞的反应完全恢复。

在KCTD16^-/-DRG神经元中巴氯芬介导的KCl诱发钙瞬变抑制减弱

使用Fura2钙成像记录由KCl溶液脉冲诱发的钙瞬变。WT和KCTD16^-/-神经元之间的峰值振幅没有差异。GABA应用同样程度地强烈抑制了WT和KCTD16^-/-神经元中KCl诱发的钙瞬变。使用巴氯芬选择性激活GABA_B受体显示，WT神经元表现出14.64%的钙内流抑制，而KCTD16^-/-神经元表现出显著减弱的反应（11.25%）。相对于WT，巴氯芬诱导的抑制在KO神经元中降低。

KCTD16^-/-小鼠具有较高的机械阈值且未显示巴氯芬的镇痛作用

在初始条件下，KCTD16^-/-小鼠的机械敏感阈值显著高于WT同窝小鼠。相反，热敏感潜伏期在两组之间没有差异。单次腹腔注射巴氯芬在WT小鼠中两种测试模式均引发强烈的镇痛作用。机械敏感性在治疗后第1和第2小时减弱，热反应潜伏期在第1和第2小时显著增加。 strikingly，KCTD16^-/-小鼠未显示巴氯芬介导的镇痛作用。机械和热阈值在所有时间点保持不变。

在周围炎症模型中，炎症增加兴奋性输入但损害KCTD16^-/-神经元中巴氯芬介导的突触前抑制

角叉菜胶诱导的周围炎症增加了WT和KCTD16^-/-小鼠脊髓背角神经元记录的mEPSC频率，与初级传入驱动增强一致。巴氯芬选择性抑制了WT神经元中的mEPSC频率，效应在冲洗后期间持续。相比之下，KCTD16^-/-神经元仅表现出短暂的抑制，未能达到显著性，随后频率在冲洗后完全恢复。事件间隔累积频率分析证实仅在WT神经元中频率降低，在KCTD16^-/-神经元中未检测到移位。振幅在整个记录过程中保持稳定，证实了GABA_B对释放概率的选择性突触前调制。

炎症减弱WT而非KCTD16^-/-神经元中的诱发抑制并减弱GABA_B调制

在炎症条件下，WT神经元中的leIPSC振幅与初始条件相比显著降低。相比之下，KCTD16^-/-小鼠中的leIPSC振幅在炎症和初始状态之间基本保持不变。巴氯芬应用在炎症条件下仅在两种基因型中产生最小且统计上不显著的leIPSC振幅降低。值得注意的是，巴氯芬冲洗后，leIPSC振幅恢复至基线，凸显了巴氯芬在炎症条件下对抑制性突触传递的弱且短暂的效应。

周围炎症保留了KCTD16依赖性痛觉敏感度并揭示了KCTD16^-/-小鼠中不同的巴氯芬镇痛作用

通过双侧皮下足底注射1%角叉菜胶诱导周围炎症性疼痛。注射后24小时评估热和机械敏感性。两组发展出类似的炎症超敏反应。有趣的是，在初始KCTD16^-/-小鼠中观察到的机械阈值升高在炎症条件下持续存在，表明这种基因型依赖性差异在周围炎症期间持续。在这些炎症条件下，巴氯芬治疗在WT和KCTD16^-/-小鼠中均产生镇痛作用，表现为热和机械阈值增加。热超敏反应在巴氯芬给药后1小时仅在WT和KO动物中减弱。巴氯芬给药的这种短暂效应也存在于测试机械敏感性的KO小鼠中。然而，在WT小鼠中，它产生了强烈且持续的抗异常性疼痛效应。

研究结论表明，KCTD16是脊髓和周围痛觉通路中GABA_B受体信号传导的关键调节因子。其在背角浅层和小直径DRG神经元中的表达与其在痛觉传递中的作用一致。KCTD16的缺失改变了背角中的兴奋性和抑制性突触传递，并改变了机械敏感性。其作用机制主要涉及突触前，调节抑制性介质的释放概率，而不是谷氨酸。KCTD16作为GABA_B受体与突触前释放机制之间的结构和功能连接器，其缺失会降低突触前GABA_B受体的功能和抑制性突触传递。在炎症条件下，KCTD16继续促进GABA_B受体依赖性对兴奋性传递的抑制，而KCTD16的缺失削弱了GABA_B受体激活对抗炎症诱导的中枢敏化的能力。行为学上，KCTD16缺失小鼠表现出较高的机械阈值，并且巴氯芬的镇痛作用减弱或消失，特别是在机械疼痛通路中。这些发现共同表明，GABA_B受体-KCTD16复合物是治疗慢性疼痛的一个有前景的新分子靶点，为开发更有效的疼痛疗法提供了新的方向。