《Neurobiology of Disease》：A Novel APP p.V742L variant in a patient with ischemic small vessel disease enhances FE65 signalling
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本研究首次报道了APP基因AICD区域p.V742L变异与家族性缺血性脑小血管病的关联。研究人员通过患者成纤维细胞实验发现，该变异通过增强AICD与FE65的相互作用，改变基因转录调控，揭示了APP非Aβ通路在脑血管疾病中的新机制，为理解APP多功能性提供了新视角。
当人们谈论淀粉样前体蛋白（APP）时，最先想到的往往是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）和脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy）。确实，APP基因的致病性变异通常位于淀粉样β（Aβ）结构域及其周边，通过影响有毒Aβ肽的产生或聚集特性而导致疾病。然而，这项发表在《Neurobiology of Disease》上的研究向我们展示了一个完全不同的故事——一个关于APP细胞内结构域（AICD）如何通过调控基因表达而影响脑血管健康的新篇章。
研究人员遇到了一位特殊的患者：59岁女性，有复发性缺血性卒中（ischemic stroke）和短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack）病史，脑部MRI显示进行性对称性白质高信号和腔隙性梗死，但没有任何脑出血或微出血的迹象。更引人注目的是她的家族史——母亲、姨妈和外祖父都有多次卒中史，提示常染色体显性遗传模式。全外显子测序（whole exome sequencing）发现了一个前所未有的APP基因变异：c.2224G>C，导致p.V742L氨基酸改变，位于APP细胞内结构域（AICD）的VTPEER基序中。
这个发现本身就很不寻常。以往与APP相关的疾病都是阿尔茨海默病或出血性卒中，而这次却是缺血性小血管病。更特别的是，p.V742L位于AICD区域，远离常见的Aβ结构域，暗示着一种全新的疾病机制。为了解开这个谜团，研究团队进行了一系列精巧的实验。
他们首先通过皮肤活检获得了患者的成纤维细胞，并设置了三个年龄和性别匹配的对照组。Sanger测序确认了患者细胞中APP p.V742L变异的存在，而RT-qPCR和Western blot分析显示APP的RNA和蛋白水平都没有变化——这说明变异的效应不是通过改变APP的表达量，而是通过改变APP的功能来实现的。
那么，这个变异到底如何影响APP的功能呢？研究人员将目光投向了APP的细胞内旅程。免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析揭示了一个重要现象：患者成纤维细胞中APP的C末端片段在溶酶体中的定位增加了。虽然溶酶体的运动性没有受到影响，但这种定位改变暗示APP的细胞内运输途径发生了改变。
更令人兴奋的发现来自转录组分析。通过3'mRNA测序，研究人员比较了患者和对照组成纤维细胞的基因表达谱，发现了186个上调基因和52个下调基因。这些差异表达的基因中，许多与APP相互作用或血管系统功能相关。例如，CCNG1（细胞周期蛋白G1）是已知的APP相互作用蛋白，而HSP90AA1（热休克蛋白90α）的单核苷酸多态性（SNP）与卒中风险相关。这些基因表达的改变提示APP p.V742L变异影响了细胞的转录调控网络。
这一发现自然引向了一个关键问题：AICD如何影响基因转录？已知AICD通过与其最重要的细胞内结合伙伴FE65相互作用来调节基因表达。研究人员合成了生物素标记的AICD肽段——包括参考肽段（REF）、磷酸模拟肽段（pREF，T743D）和患者变异肽段（PAT）——并通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）实验研究了它们与FE65的结合能力。结果明确显示：APP p.V742L变异增强了AICD与FE65的相互作用。
这一系列实验像拼图一样逐渐揭示了完整的画面：APP p.V742L变异通过改变AICD的构象，增强了其与FE65的结合能力，进而改变了基因转录调控，最终可能导致血管功能异常和缺血性卒中。
关键技术方法概述
研究采用了患者来源的成纤维细胞模型，通过免疫细胞化学和活细胞成像分析APP亚细胞定位，利用3'mRNA测序进行转录组分析，并合成生物素标记的AICD肽段结合免疫共沉淀技术研究蛋白相互作用。样本来源于一例携带APP p.V742L变异的缺血性脑小血管病患者及其家族成员。
4.1. 在脑缺血性小血管病患者中发现新型APP细胞内结构域变异
患者为59岁女性，有复发性缺血性卒中和TIA病史，脑部MRI显示进行性白质高信号和腔隙性梗死，家族史提示常染色体显性遗传模式。全外显子测序发现APP基因c.2224G>C（p.V742L）杂合变异，位于AICD区域，为目前发现的最C末端APP变异。
4.2. 患者来源成纤维细胞中APP RNA和蛋白水平未改变
通过Sanger测序确认患者成纤维细胞中APP p.V742L变异的存在，RT-qPCR和Western blot分析显示APP的RNA和蛋白表达水平与对照组无显著差异，表明变异不影响APP的表达量。
4.3. 患者成纤维细胞中C末端APP在溶酶体中的丰度增加
免疫细胞化学分析发现患者成纤维细胞中APP的C末端片段在溶酶体中的定位显著增加，而在内质网、高尔基体和早期内体中无变化。活细胞LysoTracker成像显示溶酶体运动性未受影响。
4.4. 转录组分析揭示患者成纤维细胞中疾病相关基因失调
RNA测序发现186个上调和52个下调基因，其中包括与APP相互作用（CCNG1、UCHL1）、阿尔茨海默病（HSP90AA1、GSTP1）、血管完整性（CDON、PDZRN3）和卒中风险（HSP90AA1、GDF15）相关的基因。
4.5. APP p.V742L变异干扰FE65结合
合成肽段实验表明，与参考肽段相比，患者变异肽段（PAT）与FE65的结合增强，而磷酸模拟肽段（pREF）与FE65的结合减弱，提示p.V742L变异通过改变AICD构象增强FE65亲和力。
研究结论与意义
本研究首次将APP基因AICD区域的p.V742L变异与家族性缺血性脑小血管病联系起来，揭示了不同于传统Aβ通路的新机制。该变异通过增强AICD与FE65的相互作用，改变基因转录调控，影响血管相关基因表达。值得注意的是，与以往靠近γ-分泌酶切割位点的AICD变异（如p.L723P、p.K724M）主要增加Aβ42/Aβ40比率不同，p.V742L位于更C末端，可能通过AICD特异性功能发挥作用。研究还发现该变异增加了APP在溶酶体中的定位，但未引起溶酶体运动障碍，提示内源性APP积累与过表达模型存在差异。
这项研究的重要意义在于拓展了APP在脑疾病中的多样化角色，提出了缺血性脑小血管病作为新的APP相关表型。未来研究需要在更相关的细胞模型（如iPSC分化的神经元）中验证这些发现，并探讨AICD-FE65信号通路在脑血管稳态中的具体机制。这些工作不仅有助于理解该患者的卒中病因，也将为AICD的脑功能提供新的基础见解。
