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本文报道了利用人工智能（AI）驱动的蛋白质从头设计技术，成功开发出新型CRISPR-Cas13a高效抑制剂（AIcr）。研究者针对目前缺乏天然抑制剂的LbuCas13a系统，设计了特异性靶向其HEPN核酸酶结构域的人工抑制剂，并在体外、细菌及人源细胞中验证了其强效抑制活性与作用机制，为RNA编辑工具的精准控制提供了新工具。
De novo design of potent CRISPR–Cas13 inhibitors
CRISPR-Cas系统作为革命性的基因编辑工具，其活性调控对于应用安全性至关重要。抗CRISPR（Acr）蛋白是噬菌体编码的天然抑制剂，可精确调控CRISPR-Cas系统的活性。然而，针对生物技术应用中重要的CRISPR系统（如Cas13）的Acr数量稀少且发现困难。本研究突破传统发现模式的限制，采用人工智能驱动的从头蛋白质设计方法，成功开发出新型人工设计Cas13抑制剂（AIcr）。
引言背景
CRISPR-Cas效应蛋白通过CRISPR RNA（crRNA）引导，特异性识别并切割外源遗传物质。其中II类CRISPR效应器（Cas9、Cas12和Cas13）已彻底改变了生物技术领域。特别是靶向RNA的VI型CRISPR-Cas13系统，在转录组工程和诊断应用中展现出巨大潜力。Acr蛋白能够通过多种机制抑制CRISPR-Cas系统活性，但目前已知的Cas13抑制剂仅有三种，许多具有应用价值的Cas13系统仍缺乏有效调控工具。
De novo design of Cas13 nuclease inhibitors
研究团队以LeptotrichiabuccalisCRISPR-Cas13a（LbuCas13a）为模型系统，针对其高度保守的HEPN核酸酶结构域开展抑制剂设计。利用RoseTTAFold-Diffusion（RFdiffusion）进行蛋白质支架生成，并结合ProteinMPNN进行逆折叠设计，产生了靶向HEPN核酸酶活性中心关键残基（H473）及邻近疏水残基（V411、V421和F995）的抑制剂设计方案。从10,000个初始设计中筛选出96个候选分子，通过多重结构比对分析显示这些AIcr设计具有高度结构多样性，且与已知蛋白质无显著相似性。
AIcrs inhibit Cas13 nuclease activity
建立细胞游离表达系统和高通量Cas13a活性筛选平台后，研究发现10个AIcr设计能显著抑制LbuCas13a的核酸酶活性（抑制率>50%）。通过生物层干涉技术验证结合活性，发现7个AIcr能与激活的LbuCas13a-crRNA-aRNA复合物结合。经过纯化验证，最终选定三个最具潜力的抑制剂（A11、C10和H8）命名为AIcrVIA1、AIcrVIA2和AIcrVIA3进行深入研究。
AIcrVIAs are potent, stable and true to design
活性测定显示三种AIcrVIA均具有纳摩尔级别的抑制活性（IC50约7 nM）。圆二色光谱分析证实这些AIcr的二级结构与设计预测高度一致，且具有优异的热稳定性。特别是AIcrVIA1的X射线晶体结构解析（分辨率1.9 ?）显示其实际结构与AlphaFold2预测模型高度吻合（均方根偏差约1.7 ?），验证了设计流程的可靠性。
AIcrVIAs are specific LbuCas13a HEPN nuclease inhibitors
作用机制研究表明，AIcrVIA通过竞争性抑制机制特异性靶向LbuCas13a的HEPN核酸酶活性位点。冷冻电镜结构解析（分辨率3.55 ?）直观展示了AIcrVIA1与LbuCas13a复合物的相互作用模式，特别是与β链元件（残基409-421）的密切接触。缺失该元件的LbuCas13a突变体完全丧失了AIcr抑制敏感性，证实了该区域对抑制剂结合的关键作用。交叉抑制实验显示AIcrVIA对LbaCas13a、TccCas13a和RfxCas13d等同源蛋白无抑制活性，体现了高度的特异性。
AIcrs inhibit Cas13a-mediated activity in cells
在细菌系统中，AIcrVIA能有效恢复被LbuCas13a抑制的T4噬菌体复制能力。在HEK293T细胞中建立的荧光报告系统证明，AIcrVIA可显著抑制Cas13a介导的GFP基因沉默效应，其中AIcrVIA1和AIcrVIA2展示出良好的细胞相容性，而AIcrVIA3则表现出一定细胞毒性。
讨论与展望
本研究首次实现了CRISPR-Cas13抑制剂的从头设计，仅用8周时间便获得成功率为10%的高效抑制剂，远快于传统发现方法。AIcr的设计策略可推广至其他CRISPR系统及核酸酶的设计，为精准控制基因编辑工具提供了新范式。随着AI蛋白质设计技术的不断发展，特别是AlphaFold3、Boltz-1等新工具在蛋白质-核酸相互作用预测方面的进步，定制化抑制剂设计将在研究、医疗、农业和微生物学等领域产生深远影响。
该方法克服了天然Acr发现的速度限制，为CRISPR-Cas技术的安全应用提供了强大工具。未来，通过整合更多实验数据对AI模型进行再训练，将进一步提高了设计成功率和抑制剂性能，推动精准基因组编辑技术的发展。
