《Process Biochemistry》：Synthesis, characterization, antifungal and SERS analysis of mycosynthesized silver nanoparticles against
Aspergillus parasiticus
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CRISPR修饰与亲本黄曲霉合成银纳米颗粒并评估其抗真菌活性，通过多技术表征和表面增强拉曼光谱分析发现CRISPR修饰菌株产AgNPs效果更优。
作者：Anam Ijaz 和 Muhammad Rizwan Javed
生物催化与蛋白质工程研究小组（BPERG），费萨拉巴德政府学院大学生物信息学与生物技术系（GCUF），阿拉玛·伊克巴尔路，费萨拉巴德-38000，巴基斯坦
摘要
在当前十年中，微生物纳米技术在生产关键酶和次级代谢产物方面取得了显著进展，这些产物可作为天然还原剂将金属离子还原为纳米颗粒。在本研究中，通过CRISPR改造的（M-AgNPs）及其原始菌株黑曲霉（P-AgNPs）评估了AgNPs的合成过程。这些AgNPs通过UV-Vis光谱、FTIR、TEM、SEM、DLS和XRD进行了表征。分析结果显示，合成的AgNPs在420纳米处具有特征性峰值，具有相应的官能团，呈球形，平均直径分别为8纳米和14纳米，并具有晶体结构。此外，还评估了AgNPs对产生黄曲霉毒素的寄生曲霉的抗菌活性，并测定了最小抑菌浓度（MIC）和最大杀菌浓度（MFC）。M-AgNPs和P-AgNPs的MIC分别为18.75微克/毫升和37.2微克/毫升，而它们的MFC分别为75微克/毫升和150微克/毫升。通过SERS还研究了真菌生物分子的生化变化，发现随着AgNPs浓度的增加，这些变化更为明显。M-AgNPs对寄生曲霉的抗菌活性高于P-AgNPs。本研究首次提供了针对寄生曲霉的AgNPs的详细SERS分析，有助于阐明抗菌剂的作用机制及其控制真菌感染的潜力。
引言
纳米技术是指在1至100纳米的纳米尺度范围内制造新型材料。在过去二十年里，由于其众多应用，它已成为最广泛探索和最具革命性的技术领域之一。用于合成金属纳米颗粒（NPs）的绿色技术是一个令人兴奋的前沿研究领域[1]。由于传统方法存在环境和健康风险，绿色纳米技术的应用正在显著增加。传统的合成方法包括物理方法（如离子溅射、激光烧蚀、球磨）和化学方法（如多元醇合成、喷雾热解、溶胶-凝胶法），这些方法成本高昂且涉及使用有毒化学物质，从而带来严重的生态风险。而利用细菌、植物、藻类或真菌的生物合成方法由于无毒、经济高效和快速合成而成为绿色化学中的环保选择[2]。生物合成方法的基本原理是利用生物系统中的生物分子作为还原剂将金属离子转化为NPs[3]。
微生物由于其简单的生长要求和大规模生产的潜力，成为纳米颗粒合成的核心工厂。然而，由于微生物细胞结构和代谢途径的多样性，支持微生物NPs形成的机制尚未完全理解。多项研究表明，微生物基因、辅因子、蛋白质、肽、酶和有机分子参与了通过细胞内或细胞外过程将金属离子还原为NPs的解毒和抗性机制[4]。微生物纳米技术是纳米技术与真菌学之间的交叉学科，它利用真菌进行NPs的合成。在各种生物纳米工厂中，真菌是理想的候选者，因为它们具有丰富的生物量、高金属积累能力、耐极端条件以及分泌大量生物活性代谢产物的能力（约6,400种），这些代谢产物包括蛋白质和酶，可以作为天然的还原剂和稳定剂，从而消除了对有毒化学物质和高能量输入的需求[5]。此外，由真菌代谢产物介导的细胞外合成过程简化了下游处理，无需进行细胞裂解，使得整个过程更加高效且环保。与细菌中的典型细胞内生物合成相比，纯化过程也更加便捷[6]。在先前的文献中，已经研究了包括曲霉属[7]、镰刀菌属[8]、青霉属[9]在内的多种丝状真菌在银纳米颗粒（AgNPs）合成方面的潜力。不同真菌物种合成的NPs的物理化学性质差异可归因于它们广泛的代谢产物谱。许多研究发现，酶通过与金属离子相互作用在NPs的生物合成和制备中起着重要作用[2]，[10]。已经研究了纤维素酶作为封装剂在稳定AgNPs、防止金属离子聚集方面的有效性[11]。在一项研究中，α-淀粉酶有助于合成22-44纳米大小的六边形和三角形AgNPs[12]；而在另一项研究中，使用漆酶合成了具有抗菌特性的球形AgNPs[13]。这些观察结果表明，真菌代谢产物和酶在合成具有多种特性的NPs中起着重要作用。
在各种金属纳米颗粒中，银纳米颗粒（AgNPs）在医疗保健、催化、成像、电子和光电子学等领域具有重要的应用价值，因为它们具有优异的电导率、光学性能和热导率。AgNPs因其多功能性和抗菌特性而处于纳米技术的前沿[14]。它们的高表面积和小尺寸增强了与微生物细胞膜的相互作用，从而表现出广泛的抗菌活性[15]。AgNPs对微生物细胞的作用机制是由于它们在细胞膜上的积累导致膜穿孔，破坏代谢途径，并损害DNA、蛋白质和酶等关键生物分子，从而抑制病原体复制[16]，[17]，[18]，[19]。纳米技术的进步扩展了AgNPs的应用范围，无论是单独使用还是作为基于Ag的双金属纳米复合材料，都因其有效的抗菌性能和良好的几何结构及物理化学特性而受到关注。它们在生物医学、疾病诊断与治疗、伤口愈合、食品安全和安全等多个工业领域的应用已有报道[5]，[20]。
由各种真菌引起的食物传播感染在全球范围内带来了严重的健康风险。据估计，每年有650万人患有侵袭性真菌感染，死亡率为380万人[21]。全球报告了许多真菌感染病例，包括念珠菌病（70万例）、曲霉病（25万例）、肺孢子菌肺炎（50万例）和肺曲霉病（超过300万例）[22]。食品和谷物中的霉菌毒素（真菌次级代谢产物）对人类和牲畜构成了重大威胁。霉菌毒素由曲霉属产生，即使低浓度也对人类和牲畜具有毒性。最危险的霉菌毒素包括黄曲霉毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和三萜烯[23]。其中，黄曲霉毒素尤其令人担忧，因为它们对人类和动物具有致癌性。寄生曲霉等曲霉属在食品加工、收获前后、运输和储存过程中会产生黄曲霉毒素（AFs）。四种天然存在的AFs，即黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2，被认为是强效的诱变剂、致癌物和致畸物。食品中黄曲霉毒素的存在引起了高度关注，并在许多国家受到密切监测和持续控制。纳米生物技术的最新进展促进了具有有效抗黄曲霉毒素能力的新型NPs的合成[24]。
鉴于AgNPs作为抗菌剂的重要性，在本研究中，利用CRISPR改造的（M-AgNPs）和原始菌株黑曲霉在细胞外合成AgNPs。通过UV-Vis光谱、TEM（透射电子显微镜）、SEM（扫描电子显微镜）、DLS（动态光散射）对合成的AgNPs进行了合成和形态分析，而它们的化学性质及参与制备的官能团则通过XRD（X射线衍射）和FTIR（傅里叶变换红外光谱）进行了确定。此外，还全面评估了合成的M-AgNPs和P-AgNPs对产生黄曲霉毒素的寄生曲霉的抗菌活性。据我们所知，这项研究是首次通过SERS（表面增强拉曼光谱）在分子水平上描述微生物源AgNPs对寄生曲霉的影响。因此，本研究的目标是利用CRISPR改造的（M-AgNPs）和原始菌株黑曲霉合成AgNPs，并评估其在体外生物应用中的潜力。研究结果将有助于了解稳定化合物在微生物源AgNPs合成中的作用及其抗菌特性。
章节摘录
真菌菌株的培养和接种液制备
费萨拉巴德政府学院大学生物信息学与生物技术系（GCUF）生物催化与蛋白质工程研究小组（BPERG）已有的内源性分离的黑曲霉菌株被用于通过先前描述的程序[25]对creA基因进行CRISPR-Cas9编辑。进一步筛选了CRISPR改造菌株和原始菌株，以生产水解酶，如外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。
AgNPs的微生物合成
据报道，镰刀菌氧孢子菌等丝状真菌的无细胞滤液中存在的水解酶占AgNPs合成、制备和稳定过程中所有分子的约52.6%[36]。碳代谢物抑制（CCR）是产生纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和阿拉伯糖酶等水解酶的主要障碍之一。这些降解纤维素的酶在其启动子区域含有调控元件
结论
绿色化学方法因其清洁、经济高效、环保和生物相容性以及减少有害副产物的特性而受到越来越多的关注。本研究展示了使用CRISPR改造的黑曲霉菌株的无细胞滤液合成AgNPs的方法，这些菌株含有参与AgNPs还原、封盖/稳定的重要次级代谢产物、蛋白质和酶。通过UV-Vis光谱、FTIR、TEM、SEM等手段对绿色合成的AgNPs进行了物理化学表征
作者声明
所有作者都做出了实质性贡献，并同意提交该手稿，同时承认手稿中引用的已发表的工作。此外，该手稿尚未发表或提交给任何其他期刊，如果被接受，也不会在其他地方发表。
CRediT作者贡献声明
Anam Ijaz：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析。Muhammad Rizwan Javed：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源提供、概念构思。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Muhammad Rizwan Javed博士报告称获得了巴基斯坦高等教育委员会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者们没有已知的利益冲突可能影响本文所述的工作。特别感谢费萨拉巴德农业大学（费萨拉巴德，38000）化学系的研究人员在SERS分析方面提供的技术支持。同时，也非常感谢费萨拉巴德政府学院大学生物技术系（GCUF）和巴基斯坦高等教育委员会（HEC）提供的财务支持
