《Veterinary Microbiology》：Pathogenicity assessment of Spanish West Nile virus isolates of lineages 1 and 2 in a Swiss mouse model
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为解析西班牙不同地区西尼罗病毒（WNV）疫情严重程度差异的分子机制，研究人员利用瑞士小鼠模型比较了西南部分离的谱系1（L1）与东北部分离的谱系2（L2）毒株的致病性。结果显示，西南部L1株呈现高毒力（HV），而东北部L2株为中等毒力（MV），该发现与人类和马的临床流行病学特征一致，为WNV风险分层防控提供了重要依据。
在广袤的欧亚大陆上，一种由蚊子传播的病毒正悄然改写欧洲公共卫生的版图。西尼罗病毒（West Nile Virus, WNV），这个属于黄病毒科（Flaviviridae）的RNA病毒，自1999年登陆北美后造成数万例人类感染，如今又在欧洲大陆掀起新的波澜。近年来，欧洲WNV疫情呈现显著上升趋势，两种主要遗传谱系——谱系1（Lineage 1, L1）和谱系2（Lineage 2, L2）——在多个地区同时流行。然而，一个令人困惑的现象始终萦绕在研究者心头：为何西班牙不同地区的疫情严重程度存在天壤之别？
2007年，西班牙西南部首次发现L1型WNV，随后该病毒在安达卢西亚和埃斯特雷马杜拉地区持续扩散，不仅每年引发马匹疫情，更在2020年和2024年造成两次大规模人类脑膜炎暴发，分别导致77例临床病例（8例死亡）和更为严重的疫情。与之形成鲜明对比的是，2017年在加泰罗尼亚（东北部）首次检测到的L2型WNV，尽管在当地鸟类中持续传播并越冬扩散，却仅造成零星的人类感染（2022年2例确诊，2023年1例疑似病例）。这种"同国不同命"的流行病学格局，究竟是病毒本身的生物学特性使然，还是环境因素在作祟？这一科学问题直接关系到疫情预警和风险评估的精准性，也促使研究人员深入探究病毒内在的致病性机制。
为了揭开这一谜团，来自西班牙国家农业与食品研究所动物健康研究中心（CISA-INIA）的Raúl Fernández-Delgado领衔的研究团队，在《Veterinary Microbiology》发表了一项精心设计的比较研究。他们系统收集了2007年至2020年间西班牙不同地区的WNV分离株，包括西南部的7株L1病毒（涵盖2020年暴发的3株新分离株及2012-2018年的历史株）和东北部的4株L2病毒，同时引入1937年乌干达分离的B956株（L2，中等毒力参考株）作为对照。研究采用经典的瑞士小鼠（Swiss HSD ICR (CD1)）感染模型，通过测定存活率、中位生存时间（Median Survival Time, MST）、临床症状评分及病毒组织分布等指标，结合体外Vero细胞复制动力学实验，全面评估了这些毒株的哺乳动物致病性。
研究样本队列来源明确：西南部毒株分离自加的斯、塞维利亚、马拉加和卡塞雷斯的黑秃鹫、马、小鸮和苍鹰；东北部毒株则来自莱里达和塔拉戈纳的苍鹰。所有毒株均经过Vero细胞滴定，确保接种剂量准确。
主要技术方法：研究采用四大关键技术体系：（1）体内致病性评估：4周龄雌性瑞士小鼠腹腔接种10空斑形成单位（p.f.u.）病毒，连续21天监测存活率与临床症状（0-4分评分系统），通过Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验比较毒株间差异；（2）病毒载量定量：采集脑、心、肝、脾、肾组织，经TissueLyser II匀浆后使用BioSprint15工作站提取核酸，采用高灵敏度RT-qPCR（检测限<50拷贝）检测WNV基因组，并以β-actin mRNA作为内参；（3）血清学检测：存活小鼠于21天采集血清，使用ID Screen West Nile Competition ELISA检测抗体；（4）体外复制动力学：选取4株2020年分离株（SPA20-01、SPA20-02、AC913、AC924）及B956株，以0.01感染复数（MOI）感染Vero细胞，连续5天收集上清，通过RT-qPCR和半数组织培养感染剂量（TCID）滴定测定病毒复制水平，采用线性混合效应模型（LME）进行统计学分析。
研究结果
3.1 小鼠模型中的致病性：所有接种小鼠均成功感染（除1株L1感染率为91.7%外，其余均为100%）。西南部L1分离株展现出惊人的致死性——6株均导致100%死亡率（12/12或11/11），中位生存时间仅8-9天，临床体征于6-7天出现，7-9天内全部死亡。相比之下，东北部L2分离株的毒性显著降低：AC923和B956死亡率仅66.7%（8/12），AC568为91.7%（11/12），AC913和AC924虽达100%但中位生存时间延长至11天。Kaplan-Meier分析证实，所有西南部株系间无显著差异（P>0.1），可归为高毒力（Highly Virulent, HV）组；东北部株系与B956间亦无差异，归为中等毒力（Moderately Virulent, MV）组；但两组间差异极显著（P<0.05）。
3.2 器官病毒载量：脑组织是所有毒株复制的主要靶器官，但西南部HV株的病毒载量（Ct值17.5-20.7）显著高于东北部MV株（Ct值22.4-31.2）。更关键的差异体现在神经外播散能力：HV株在脾、心、肝、肾中均检测到高滴度病毒（++至+++，Ct值28.5-36.8），而MV株仅在少数器官的低比例样本中检出弱阳性（+至++，Ct值33.2-39.6），B956株甚至在脾脏中完全阴性。这种外周器官的复制差异与毒力表型高度一致。
3.3 细胞培养中的复制动力学：体外实验结果与体内致病性存在明显脱节。RT-qPCR显示所有西班牙分离株的基因组复制水平均显著高于B956（P<0.01），但TCID滴定仅发现SPA20-01与B956在3天和5天、SPA20-02与B956在2天和3天存在显著差异（P<0.05）。西班牙株系间几乎无差异（仅SPA20-01与AC924在5天有差异，P=0.02）。这表明单纯依赖细胞培养无法准确预测WNV的哺乳动物毒力。
研究结论与意义
本研究通过严谨的体内外实验，首次系统证明了西班牙WNV流行的地理差异与病毒内在致病性密切相关。西南部L1型WNV（属于WMed-1.2和WMed-1.3变异株，位于谱系1第2和第7簇）在瑞士小鼠中表现出稳定的高毒力特征，而东北部L2型（属于意大利伦巴第簇）则呈现中等毒力，这与人类和马匹中的临床流行病学数据高度吻合——2020年西南部暴发77例人类病例，而东北部同期仅报告马匹疫情且无人类感染。
然而，研究也揭示了更深层的复杂性：2020年西南部疫情的严重性并非源于病毒毒力的突然增强，因为2012-2020年间分离的L1株系毒力稳定。研究人员推测，疫情加剧可能归因于病毒对当地宿主或媒介的适应性进化，或2020年异常活跃的媒介蚊虫（Culex perexiguus）种群暴发。此外，红腿鹧鸪对西南部毒株更高的宿主适合性也可能促进了病毒传播循环的放大。
该研究的公共卫生意义在于：首先，确立了小鼠模型作为WNV毒力分型的可靠工具，可指导风险地图的绘制和针对性预防；其次，警示不能简单按谱系划分毒力——L1和L2内部均存在毒力多样性，必须对每株新分离病毒进行独立评估；最后，强调体外复制实验不足以替代动物模型，开发基于原代细胞或组织外植体（ex vivo explants）的新型预测方法仍是未来方向。对于西班牙而言，这一发现意味着西南部地区需要维持最高级别的WNV监测和媒介控制力度，而东北部地区虽风险较低，但仍需警惕L2病毒的持续进化。在全球气候变化和蚊媒分布扩大的背景下，这种基于病毒生物学特性的精准风险评估，将为新兴虫媒病毒病的防控提供关键科学依据。
