《Virology》：Combination immunization with mRNAs encoding PRRSV antigens enhances immune responses and confers protective immunity against highly pathogenic PRRSV in piglets
编辑推荐：
mRNA疫苗通过编码PRRSV结构蛋白（GP3/4/5、M、N）及融合蛋白（GP345、GP5MN），结合脂质纳米颗粒递送，在小鼠中显示组合免疫（GP3+4+5、GP5+M+N）比融合蛋白（GP345、GP5MN）更优，并激活更强的细胞免疫（IFN-γ）。猪试验表明GP5+M+N疫苗诱导中和抗体与灭活疫苗相当，且细胞免疫更强，有效保护猪只免受PRRSV攻击。验证了多抗原组合mRNA疫苗设计的优势。
刘海云|马玉清|侯凤萍|滕志东|姜立新|乔璐|穆罕默德·蒙塔齐尔·梅赫迪|尹双辉|郭慧晨|孙世琦
中国农业科学院兰州兽医研究所动物疾病控制与预防国家重点实验室，中国兰州
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）给畜牧业造成了巨大的经济损失。由于该病毒的遗传变异性强，且传统疫苗诱导的细胞免疫反应有限，现有的疫苗防护效果不足。相比之下，mRNA疫苗在抗原设计上具有灵活性，并能增强细胞免疫反应，为PRRSV疫苗接种提供了有前景的解决方案。在本研究中，我们构建了多种编码PRRSV结构蛋白GP3、GP4、GP5、M和N以及融合蛋白GP345和GP5MN的mRNA，将其封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中，然后通过单独使用融合蛋白mRNA-LNPs或组合使用结构蛋白mRNA-LNPs对小鼠进行免疫，以评估其体内免疫原性。为了进一步评估保护效果，我们将GP5+M+N和GP3+4+5与市售灭活疫苗进行了比较。结果表明，GP5+M+N不仅能够引发与灭活疫苗相当的体液免疫反应，还显著增强了干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，并为小鼠提供了有效的保护。研究显示，GP5+M+N比GP5MN能诱导更强的特异性抗体反应和细胞免疫反应；GP3+GP4+GP5组合诱导的细胞免疫反应也优于GP345。这些结果不仅验证了PRRSV mRNA疫苗的应用潜力，还表明表达单一抗原的mRNA组合免疫优于表达多种抗原融合蛋白的mRNA。本研究为PRRSV mRNA疫苗的合理设计提供了理论支持和实践指导。
引言
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）于20世纪80年代首次在北美被报道，随后传播到欧洲（Han等人，2014年）。自此，它成为一种全球性的流行疾病，对养猪业构成了巨大威胁，因为该病毒会导致母猪繁殖失败和各年龄段猪只的呼吸系统疾病（Montaner-Tarbes等人，2019年）。其病原体——猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种有包膜的单链正链RNA病毒，属于动脉病毒科（Arteriviridae）和尼多病毒目（Nidovirales）（Zhang等人，2022年；Fang等人，2012年）。PRRSV在自然群体中表现出显著的遗传和抗原多样性（Ramos等人，2022年；Chaudhari等人，2020年）。该病毒主要分为两个基因型：基因型I（欧洲型）和基因型II（北美型）。这两种基因型之间的序列差异可达40%，而同一基因型内的变异仍可能超过20%（Xu等人，2024年；Zhang等人，2024年）。PRRSV专门攻击单核吞噬细胞系，抑制宿主免疫反应并显著延缓中和抗体的产生（Lunney等人，2016年；Ma等人，2021年）。尽管全球范围内进行了大量研究以控制PRRSV，但有效的预防和治疗策略仍然有限（Perez-Duran等人，2024年；Du等人，2024年）。灭活疫苗被广泛使用，但存在交叉保护力弱、潜在的生物安全问题以及细胞免疫反应诱导不足等缺点（Li等人，2024年；Zhang等人，2023a）。因此，开发能够克服这些局限性的新型疫苗平台至关重要。
mRNA技术以其高效传递遗传信息的能力而成为疫苗开发、基因治疗和癌症免疫治疗的有前景的平台（Zhang等人，2023b）。这种分子具有内在的免疫刺激作用，能够激活先天性和适应性免疫反应，特别是T细胞和B细胞介导的免疫，这对抗病毒防御至关重要（Gilbert等人，2016年）。此外，通过脂质纳米颗粒递送的mRNA进入宿主细胞后，在细胞质中短暂翻译和表达，而不会进入细胞核，从而消除了基因组整合的风险，确保了良好的安全性（Sandbrink等人，2020年；Le等人，2022年；Ye等人，2023年）。体外转录技术的进步进一步提高了mRNA生产的效率和可扩展性，促进了疾病预防和控制的快速响应能力（Ye等人，2023年）。因此，基于mRNA的PRRSV疫苗的开发具有巨大潜力。
抗原的选择和设计是疫苗效力的关键决定因素。最近对PRRSV mRNA疫苗的研究表明，使用编码融合蛋白GP2-GP4和GP3-NSP9的mRNA进行组合免疫比单独免疫能引发更强的免疫反应。值得注意的是，在本研究中未表达GP5-M融合蛋白（Khan等人，2024年）。Zhou等人报告称GP2-GP5-M mRNA未能引发显著的免疫激活（Zhou等人，2024年），而Mou等人发现GP5-M融合蛋白比编码全长N、M和E蛋白表位肽的mRNA疫苗能引发更强的免疫反应（Mou等人，2025年）。此外，最近的一项研究表明，多蛋白表位mRNA疫苗能有效保护小鼠免受高致病性PRRSV的侵害（Liu等人，2025年）。这些研究表明，开发PRRSV mRNA疫苗需要综合考虑多种抗原成分，抗原的组合和呈现方式对免疫结果有显著影响。在PRRSV表位研究中，GP5被确定为关键结构蛋白；突变其诱饵表位可以增加中和表位的暴露，从而提高中和抗体的产生（Plagemann，2004年；Popescu等人，2017年）。此外，共表达GP3和GP4比单独表达GP5更能协同增强中和抗体的产生（Jiang等人，2008年）。类病毒颗粒（VLPs）能够模拟天然病毒颗粒的抗原表位呈现方式，特别是通过保持其三维构象，从而有效引发强烈的体液免疫反应。研究证实PRRSV的GP5、M和N蛋白能够形成VLPs（Uribe-Campero等人，2015年）。
因此，在本研究中，我们设计并构建了编码PRRSV结构蛋白GP3、GP4、GP5、M和N的mRNA分子作为目标抗原。我们还生成了两种通过柔性（G4S）3连接器连接的多结构蛋白mRNA构建体，分别命名为GP345和GP5MN。将这些mRNA封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中后，对小鼠进行免疫，以评估不同的抗原组合，比较GP3+GP4+GP5（GP3+4+5）和GP5+M+N与相应的融合构建体GP345和GP5MN的免疫原性。结果表明，GP3+4+5和GP5+M+N诱导的体液和细胞免疫反应显著强于GP345和GP5MN，这突显了多抗原组合在PRRSV mRNA疫苗设计中的关键作用。为了进一步评估在自然宿主体内的免疫潜力，我们将GP3+4+5和GP5+M+N与市售灭活疫苗在猪身上进行了比较。结果表明，GP5+M+N引发的体液免疫反应与灭活疫苗相当，同时更强烈地激活了T细胞免疫并显著增强了IFN-γ的分泌，为小鼠提供了有效的保护。这些发现进一步支持了基于多抗原的mRNA疫苗策略在预防和控制PRRSV感染中的可行性和优势。
部分片段
细胞与病毒
非洲绿猴肾上皮细胞（Marc-145）和人胚胎肾293T细胞（HEK293T）在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Invitrogen，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中培养。PRRSV JX-A1菌株在Marc-145细胞中繁殖。灭活的PRRSV通过蔗糖梯度离心纯化，其蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒进行测定（Beyotime）。PRRSV mRNA疫苗的构建与表征
设计了七种不复制的mRNA，编码PRRSV的结构蛋白，包括GP3、GP4、GP5、GP345、M、N和GP5MN（图1A）。这些mRNA经过1-甲基伪尿苷-5′-三磷酸修饰，并通过体外转录合成。变性琼脂糖凝胶电泳确认所有mRNA的大小与其理论长度一致（图1B）：GP3（1065 nt）、GP4（837 nt）、GP5（909 nt）、M（831 nt）、N（678 nt）、GP345（2328 nt）和GP5MN（1923 nt）。随后，讨论
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种高度变异的有包膜RNA病毒，其全球流行模式特征是多种菌株的长期共存（He等人，2025年）。多种基因型和变体的持续传播导致了养猪业的严重和持续的经济损失。自出现以来，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）由于其高毒力、快速传播等特性，一直是一个主要威胁。
结论
在本研究中，我们使用mRNA疫苗平台成功开发了七种针对PRRSV的特异性mRNA构建体。通过在小鼠模型中比较组合mRNA-LNPs策略与融合蛋白mRNA-LNPs策略的免疫原性，我们证明了组合mRNA疫苗在引发体液和细胞免疫反应方面具有显著优势。其中，GP3+4+5和GP5+M+N mRNA-LNPs配方有效诱导了PRRSV特异性中和抗体。
CRediT作者贡献声明
刘海云：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学，数据管理，概念化。马玉清：验证。侯凤萍：撰写——审稿与编辑。滕志东：资源提供。姜立新：验证。乔璐：验证。穆罕默德·蒙塔齐尔·梅赫迪：撰写——审稿与编辑。尹双辉：资源提供。郭慧晨：撰写——审稿与编辑，资金筹集。孙世琦：撰写——审稿与编辑，监督，概念化，资金筹集。
伦理批准
所有动物实验均获得了中国农业科学院兰州兽医研究所动物护理与伦理委员会的批准（批准编号：LVRIAEC-2023-088，LVRIAEC-2025-115）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了甘肃省科技计划（25YFNA014, 25JRRA1089）的支持。此外，我们也感谢兰州兽医研究所中央仪器室提供的设备支持。
