《Virology》：Viral metagenomics reveals the RNA viral composition of herbivorous wildlife on the Qinghai-Tibet Plateau
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本研究在青藏高原三地采集741份野生食草动物粪便样本，通过病毒组学分析鉴定出18个RNA病毒科，其中5科新毒株与人类及旱獭病毒亲缘关系密切，揭示高原野生动物是未知的RNA病毒潜在储存宿主，对公共卫生和畜牧业构成威胁，为后续监测提供数据支持。
陈月|黄世寅|张双|王海宣|宋晓菲|季立凯|沈全|杨世兴|刘宇伟|王晓春|吴平|杨洪峰|单同玲|王小龙|张文
中国江苏省镇江市江苏大学附属医院重症医学研究所
摘要
RNA病毒是一类在自然界中广泛分布的病原体，具有极高的遗传多样性和快速的进化潜力。以青藏高原为代表的高海拔生态系统，由于其独特的环境条件，可能孕育着独特的病毒群落。然而，关于这种极端环境下野生动物中RNA病毒的组成和分布，目前仍缺乏系统的了解。在这项研究中，我们从青藏高原的三个地区收集了741份粪便样本，并利用病毒宏基因组技术揭示了这些地区六种草食性野生动物粪便样本中RNA病毒的组成和多样性。我们鉴定出了大量的RNA病毒，这些病毒被归类为18个不同的病毒科。此外，不同宿主物种之间的病毒群落结构也存在差异。通过组装分析，我们鉴定了属于Astroviridae、Picornaviridae、Picobirnaviridae、Tobaniviridae和Caliciviridae科的28个病毒序列。系统发育分析表明，新鉴定的病毒株与人类、旱獭和其他哺乳动物中的病毒具有密切关系。研究结果表明，该地区的野生动物是尚未被发现的RNA病毒的宿主，其中一些病毒可能对公共卫生和畜牧业构成潜在威胁。这些发现为未来的病毒监测、生态风险评估以及从源头上预防和控制新发传染病提供了重要的科学依据和数据支持。
引言
青藏高原（QTP）被誉为“世界屋脊”和“第三极”（Wu等人，2016年），是地球上海拔最高（平均海拔超过4000米）且面积最大的地区（Wu等人，2022年）。极端的环境条件，如低温、缺氧和强烈的紫外线辐射，形成了一个具有独特结构和相对功能稳定性的高原生态系统。该地区拥有丰富的有蹄类动物物种（例如斑马羚、野牦牛），占中国有蹄类动物种类的42%（Shi等人，2023年）。然而，高原生态系统对外部干扰的抵抗力较低，目前正面临气候变化和人类活动的双重威胁（Jiang等人，2023年）。一方面，高原生态系统对全球气候变化非常敏感（Gao等人，2013年）。全球变暖加速了冰川融化，促进了永久冻土的退化，并改变了区域水文过程，间接影响了野生动物的栖息地生态完整性。另一方面，人类活动，包括基础设施建设和牧场扩张，直接破坏和分割了原始栖息地，导致栖息地破碎化日益严重（Chen等人，2013年）。因此，野生动物的活动范围逐渐向人类社区和牲畜放牧区靠近。这显著增加了野生动物、人类和家畜之间的接触频率，为病原体（尤其是病毒）的传播创造了更有利的条件（Mori和Roest，2018年；Woolhouse和Gowtage-Sequeria，2005年）。据报道，在1990年至2010年间，RNA病毒导致了94%的人畜共患病（Carroll等人，2018年）。
RNA病毒以核糖核酸（RNA）作为遗传物质，并依赖RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）进行复制。这两个核心特征在分子稳定性和进化动态方面将它们与DNA病毒区分开来（Joklik，1980年），从而对其传播模式产生了重大影响，并对疾病预防和控制带来了挑战。大多数RNA病毒具有单链结构。一旦病毒颗粒破裂，由于缺乏衣壳蛋白的保护，基因组RNA容易受到核酸酶的降解（Gunawardene等人，2021年）。同时，缺乏双链互补结构的稳定支撑使得它们在pH值和温度等环境因素的影响下更容易发生构象变化（Simon和Gehrke，2009年）。此外，它们的复制依赖于缺乏校正功能的RdRp（Villa等人，2021年）。这导致复制过程中碱基插入错误率显著增加，以及频繁的突变（Castro等人，2005年）。众所周知，RNA病毒的自发突变率远高于DNA病毒和微生物（Combe和Sanjuán，2014年；Drake，1999年）。这种高突变性使它们能够快速适应新的宿主环境，不断产生新的变异株，并在宿主体内发生重组，从而便于传播到其他宿主（Dolan等人，2018年）。这些特征给病毒疫苗的研发和疾病预防控制策略的实施带来了重大挑战（Wadas和Domingues，2025年）。
动物感染RNA病毒后，常常会引发一系列复杂的临床症状，其进一步传播对动物种群和公共卫生构成持续威胁。这种威胁通常表现为跨物种传播的风险。例如，星状病毒可以感染多种动物物种（Atkins等人，2009年；Farkas等人，2012年；Jonassen等人，2003年），主要引起胃肠炎（Woode和Bridger，1978年）。它们展示出的跨宿主传播能力突显了RNA病毒在自然宿主群落中持续进化的潜在风险。特别是在野生动物和牲畜活动范围交汇的生态界面上，这种溢出事件可能导致严重的健康和经济后果。以Picornaviridae科的口蹄疫病毒（FMDV）为例，其在野生动物和牲畜之间的潜在溢出是导致圈养野生动物爆发的主要原因（Ijaz等人，2022年）。由于FMDV传播迅速、预防和控制困难以及有效对策有限，它造成了巨大的经济损失和破坏，成为畜牧业的“主要威胁”（Farsang等人，2013年）。在青藏高原等地区，野生有蹄类动物和畜牧业活动之间存在显著的地理重叠，形成了病毒交换的潜在热点。
在青藏高原这样的独特生态环境中，草食性野生动物面临的病毒感染压力以及它们所携带的病毒群落结构可能与其他地理区域有所不同。高海拔地区存在一系列特有的环境压力因素，包括强烈的紫外线辐射、慢性缺氧和显著的温度波动（Jia等人，2020年）。这些环境条件对当地病毒群落施加了独特的进化压力。它们不仅选择了适应极端条件的病毒株，还通过影响病毒复制效率、传播途径和进化轨迹，塑造了与低海拔或温带栖息地不同的病毒适应特征（Gil等人，2021年）。在这种生态系统中，极端环境因素与宿主生物之间的相互作用塑造了独特的病毒持续性和多样化模式，推动了它们独特的进化路径。这使得这些生态系统成为研究病毒-宿主共同进化机制和途径的理想自然实验室（Manuel和Snyder，2024年）。此外，斑马羚、藏羚羊和野牦牛等草食性野生动物是高原生态系统的重要组成部分。它们独特的生命史、季节性迁徙模式以及与牲畜和其他野生动物的生态互动，为多宿主病毒传播和适应性进化创造了特定的生态环境（Walker等人，2018年）。通过这些生态联系形成的复杂网络，病毒可以在牲畜、野生动物和人类之间实现跨物种传播（Cunningham等人，2017年）。
与许多DNA病毒相比，某些RNA病毒在环境中的拷贝数可能较低，且它们的RNA基因组在无保护条件下更容易降解（Zwieb，2014年）。这些特征使得使用传统方法（如病毒培养）进行分离和检测面临更大挑战（Mokili等人，2012年）。然而，宏基因组学、高通量测序和生物信息学等技术的创新，加上对宿主-病原体共同进化和生态动态等生物学因素的日益了解，显著加快了病毒发现的步伐（Debat和Bejerman，2025年）。这些方法使我们能够探索以前无法进入的生态位，并直接从样本中全面揭示病毒遗传信息，从而揭示了前所未有的RNA病毒多样性（Ankolekar等人，2024年；Shi等人，2016年；Zhang等人，2006年）。尽管全球范围内在野生动物RNA病毒研究方面取得了显著进展，但针对青藏高原草食性野生动物的RNA病毒的研究仍然相对较少。这在很大程度上是由于高海拔地区采样困难以及样本在保存和运输过程中易降解的挑战（Debat和Bejerman，2025年）。
在全球生态变化的背景下，起源于野生动物的新发传染病已成为威胁公共卫生安全和生态安全的重大风险因素。迫切需要开展野生动物源病原体的基线调查并评估其溢出风险（Onyuok等人，2019年；Tompkins等人，2015年）。为此，本研究采用病毒宏基因组学技术分析了青藏高原741份草食性野生动物粪便样本中的RNA病毒。该研究旨在阐明这些野生动物携带的RNA病毒的群落组成、多样性和进化关系，从而识别新发现病毒与已知病毒之间的联系。最终目标是为监测、预警和控制青藏高原上的野生动物传播疾病提供科学依据，同时为保护生态系统完整性和维护该地区的生物多样性提供数据支持。
样本收集与处理
2023年9月至10月期间，我们从青藏高原的三个地区收集了六种草食性野生动物的粪便样本——斑马羚（Pseudois nayaur）、腹股沟瞪羚（Gazella subgutturoa）、藏羚羊（Procapra picticaudata）、白唇鹿（Cervus albirostris）、野牦牛（Bos mutus）和盘羊（Ovis aries），共获得741份样本。具体来说，230份样本来自怀头塔拉镇，439份来自徐家镇，72份来自柴丹音马克夏。
病毒组概述
我们从中国青海省的三个采样点收集了741份草食性野生动物的粪便样本。根据采样地点和野生动物种类，将这些样本合并为148个样本池进行病毒宏基因组分析（图1a）。经过Illumina测序后，去除了与细胞生物（古菌、细菌和真核生物）和其他非病毒相关序列的读段，得到了44,465,235个类似病毒序列的读段。
讨论
本研究采用病毒宏基因组学方法系统地描述了青藏高原六种草食性野生动物粪便样本中存在的高度多样化的RNA病毒群落。我们的发现不仅证实了高原生态系统是RNA病毒遗传资源的储存库，更重要的是揭示了跨物种传播的潜在风险。
我们鉴定了属于18个不同病毒科的RNA病毒，包括单链和
结论
总之，本研究初步调查了青藏高原草食性野生动物粪便中的RNA病毒，揭示了该地区RNA病毒组的高度多样性。结合系统发育分析，我们的结果表明高原生态系统内存在复杂的病毒流动和宿主适应模式。这强调了建立长期、全面的病毒监测系统以监测病毒种群动态和评估其
CRediT作者贡献声明
陈月：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、调查、数据分析、数据管理。黄世寅：写作——审稿与编辑、可视化、方法学、调查。张双：写作——审稿与编辑、方法学、调查。王海宣：写作——审稿与编辑、调查。宋晓菲：写作——审稿与编辑、调查。季立凯：写作——审稿与编辑、调查。沈全：写作——审稿与编辑
资助
本研究得到了中国国家重点研发计划（编号2023YFD1801300 和 2022YFC2603801）以及国家自然科学基金（编号82341106对张文的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢青海省地方病预防控制研究所、黑龙江省野生动物疾病与生物安全管理重点实验室和中国农业科学院上海兽医研究所的支持和鼓励。
