基于杆状病毒的牛细小病毒VP2嵌合病毒样颗粒的开发：该颗粒同时表达口蹄疫病毒SAT2-VP1的B细胞和T细胞抗原，并在BALB/c小鼠中评估了体液免疫和细胞免疫反应
《Virology》：Development of a Baculovirus-Derived Bovine parvovirus VP2 Chimeric Virus-Like Particles Co-displaying FMDV SAT2-VP1 B- and T-cell Epitopes and Evaluation of Humoral and Cellular Immunity in BALB/c Mice
编辑推荐：
本研究通过构建嵌合BPV VP2病毒样颗粒，整合SAT2口蹄疫病毒和B细胞及T细胞表位，利用baculovirus表达系统生产，并评估免疫反应。结果显示BT3嵌合VLP诱导最强中和抗体，结构稳定，为防控双病毒感染提供了新策略。
阿什纳菲·基罗斯·乌布谢特（Ashenafi Kiros Wubshet）、丁耀忠（Yaozhong Ding）、周洛毅（Luoyi Zhou）、王阳（Yang Wang）、戴俊飞（Junfei Dai）、李倩（Qian Li）、李国秀（Guoxiu Li）、纳霍姆·所罗门（Nahom Solomon）、何继军（Jijun He）、尹向平（Xiangping Yin）、奇梅德策伦·巴亚斯加兰（Chimedtseren Bayasgalan）、乌扬加·特穆金（Uyangaa Temuujin）、郭丽军（Lijun Guo）、孙玉杰（Yujie Sun）、阿布拉哈·布斯拉特（Abrha Bsrat）、王文秀（Wenxiu Wang）、唐娜（Na Tang）、阿列克谢·D·扎别列日尼（Alexei D. Zaberezhny）、利维奥·希斯（Livio Heath）、孙月峰（Sun YueFeng）、张杰（Jie Zhang）
中国农业科学院兰州兽医研究所国家/世界动物卫生组织口蹄疫参考实验室，兽医病因生物学国家重点实验室，中国兰州
摘要
背景
近期口蹄疫病毒（FMDV）的暴发表明，南方非洲地区2型（SAT2）血清型已迅速传播到中东、西亚以及与俄罗斯接壤的地区。这种病毒的传播对全球畜牧业构成了严重威胁，尤其是在此前未出现过该血清型的国家。尽管研究较少，但FMDV与牛瘟病毒（BPV）的共感染也会给养牛业带来巨大的经济损失。因此，开发一种安全且成本效益高的双靶点疫苗平台对于应对这些挑战至关重要。我们之前的研究发现，BPV VP2病毒样颗粒（VLPs）具有很高的物理化学稳定性。在本研究中，我们开发了一种潜在的嵌合病毒样颗粒（cVLP）疫苗候选物，旨在同时抵御SAT2 FMDV和BPV的感染。目前尚不存在此类疫苗。
方法
本研究鉴定了SAT2 FMDV VP1（病毒蛋白1；PAT/1/2012，GenBank: JX014256）中的中和B细胞（135–174 aa）和T细胞表位（200–213 aa、66–80 aa和21–40 aa），并将其插入BPV VP2（病毒蛋白2；GenBank: N191349.1）序列的选定位点（395–396 aa、391–392 aa、274–275 aa和271–272 aa），然后使用杆状病毒表达系统进行表达。由此产生了不含T细胞表位的cVLP（B）以及分别含有一个、两个或三个T细胞表位的cVLP（BT0、BT1、BT2、BT3）。在BALB/c小鼠中的免疫原性评估显示，这些cVLP能够引发强烈的体液和细胞免疫反应，评估方法包括ELISA、ELISpot、细胞内细胞因子染色（ICS）和SVS-SAT2-VP1假病毒中和试验。
结果
研究结果表明，在BPV cVLP表面展示更多的SAT2 FMDV VP1 T细胞表位可以增强体液和细胞免疫反应。BT3-cVLP在假型中和试验中表现出强烈的中和潜力，表明其在预防FMDV和BPV共感染方面具有很好的效果。这种创新的双价疫苗平台适用于地方性流行地区，也可作为无FMDV-SAT2国家的战略储备。
引言
在过去两年（2022–2024年），SAT2型口蹄疫病毒（FMDV）的传播速度惊人。中东地区的疫情报告显示，该血清型已逐渐扩散至西亚，并最近到达了与俄罗斯接壤的地区（1）。2023年1月，巴林、约旦和阿曼报告了SAT2/XIV型疫情。到2023年3月，病毒已传播到土耳其的安纳托利亚东部，随后又扩散到安纳托利亚中部和阿达纳省（2）。这种血清型的传播对全球畜牧业构成了严重威胁，尤其是在此前未出现过SAT2 FMDV的国家。更重要的是，SAT2 FMDV具有高度的抗原变异性，包含14个顶型，这些顶型之间缺乏交叉保护作用。14个SAT2顶型的VP1编码区核苷酸序列同源性约为80%（3, 4）。
VP1蛋白是结构最易变异的外壳蛋白，在SAT2中长度为213至219个氨基酸，其140–150位和166–170位存在插入或缺失的情况（5）。最近从VP1蛋白中提取的肽片段经过化学合成后，在实验动物中显示出良好的保护作用（6）。VP1的N端和C端的氨基酸140–160（B细胞表位）和200–213（通用T细胞表位）是免疫原性最强的区域（7）。Opperman等人也确定了VP1的144–154位和200–213位为免疫原性表位，分别位于GH环和C末端（8）。SAT2 VP1的21–60位T细胞表位已被证明能刺激T细胞受体（TCR）（9）。Wilhelm等人还发现VP1区域的66–80位氨基酸是FMDV特异性的T细胞表位，对诱导牛的免疫力至关重要（10）。因此，多表位疫苗是针对SAT2血清型的理想选择，因为该血清型的VP1外壳蛋白具有最高的抗原变异水平（11）。
免疫信息学和计算疫苗学方法通过缩短研发时间和降低生产成本，彻底改变了传统的疫苗开发方式（12, 13）。基于表位的亚单位疫苗属于第三代疫苗开发技术，可以产生高滴度的抗体，并增强CD4+、CD8+和NK细胞的激活（14, 15）。单个或多个表位可以以高度有序和重复的形式呈现在纳米颗粒或病毒样颗粒（VLPs）上，从而引发强烈的免疫反应（16, 17）。基于表位的嵌合疫苗设计有望克服许多传统疫苗的局限性，这些传统疫苗未能有效预防FMD暴发（4, 18）。Wang等人合成了包含中和B细胞和T细胞表位的嵌合肽疫苗（19）。
在E. coli中表达的O型FMDV VLPs在猪和牛中均引发了保护性免疫反应，证明了该疫苗在自然宿主体内的可行性和有效性（20）。同样，基于兔出血病病毒（RHDV）并展示FMDV表位的cVLPs也在猪体内引发了保护性免疫（21）。
牛瘟病毒（BPV）是全球畜牧业中一个被忽视但重要的问题，其在牛群中的流行率为83%–100%，尤其影响犊牛（15）。与其他大多数细小病毒一样，BPV对化学和物理灭活具有高度抵抗力。最可靠的消毒方法是使用0.5%的氯漂白剂或10%环氧乙烷与90%二氧化碳的非爆炸性混合物（22）。此外，该病毒在-20°C下可存活长达六个月（23）。目前尚无有效的BPV疫苗，也没有能够同时抵御SAT2 FMDV和BPV的疫苗。因此，开发一种能够同时预防FMDV和BPV感染的疫苗平台至关重要。
最近的研究成功利用细小病毒的结构蛋白VP2生成了展示FMDV表位的病毒样颗粒（VLPs），为多价疫苗的开发提供了多功能平台。Chang等人生产了展示O型FMDV表型的BPV VP2 VLPs，证明了这种方法的可行性（24）。Pan和高等人展示了O型FMDV的表型（25, 26），而Li等人的最新研究则成功改造了PPV VP2 VLPs以展示SAT2 FMDV血清型的表型（27），证实这些细小病毒VLPs是稳定的、无传染性的颗粒，适合有效呈现多种FMDV抗原（27）。
因此，本研究旨在利用昆虫表达系统构建和生产展示SAT2 FMDV VP1免疫优势B细胞和T细胞表型的嵌合BPV VLPs，并通过多种方法对其进行了评估和表征。此外，还在BALB/c小鼠中评估了这种新型疫苗引发的体液和细胞免疫反应。
实验部分
昆虫细胞培养
我们在中国农业科学院兰州兽医研究所（LVRI-CAAS）实验室保存的Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞。这些细胞在SF900II无血清培养基（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，添加1–5%的胎牛血清（FBS），并在27–28°C、130 rpm的摇床中培养，保持健康状态直至使用。
重组杆状病毒的构建与生成
BPV 1型血清株Haden的VP2编码序列（GenBank）
重组杆状病毒的构建、生成及VLP的表征
将BPV的VP2基因克隆到polyhedron-promoter驱动的pFastBac1中，生成了五种重组杆状病毒载体（rBacmid-BPV-VP2、rBacmid-BT0、rBacmid-BT1、rBacmid-BT2和rBacmid-BT3），每种载体均包含了SAT2 FMDV的B细胞和T细胞表位序列（补充图2）。重组杆状病毒（P1、P2和P3）及载体对照在Sf9细胞中通过bacmid转染后得到拯救。讨论
本研究表明，基于BPV-VP2的病毒样颗粒为展示SAT2 FMDV的B细胞和T细胞表型提供了多功能且高免疫原性的平台。使用杆状病毒-Sf9表达系统成功构建并生产了五种嵌合BPV-VLP（BT0–BT3），且没有影响衣壳组装、结构完整性或抗原呈递能力。这些发现与先前的研究结果一致，即细小病毒衣壳能够耐受外源表位
结论
含有SAT2-FMDV T细胞和B细胞表型的嵌合BPV-VLPs保持了正确的折叠和组装结构，证实了其结构稳定性。这些构建体在小鼠中引发了强烈的体液和细胞免疫反应，其中BT3诱导了最高的FMDV和BPV特异性中和抗体水平。增强的免疫原性与T细胞表位的增加表面展示相关，进一步凸显了BT3作为多价疫苗候选物的潜力。
CRediT作者贡献声明
孙玉杰（Yujie Sun）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、资源获取、实验设计。张杰（Jie Zhang）：撰写、审稿与编辑、资源管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念框架。郭丽军（Lijun Gu）：撰写、审稿与编辑、数据验证、方法学设计、数据分析。阿布拉哈·布斯拉特（Abrha Bsrat）：撰写、审稿与编辑、数据验证、资源管理、数据分析。阿列克谢·扎别列日尼（Alexei Zaberezhny）：撰写、审稿与编辑、数据可视化、数据验证、资源管理。戴俊飞（Junfei Dai）：撰写伦理批准
动物实验遵循中国农业科学院兰州兽医研究所（LVRI，北京）制定的实验室动物管理和使用规程进行。中国农业科学院LVRI的动物伦理委员会（LVRIAEC-2023-063）批准了所有实验方案。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
数据可用性声明
作者声明本文生成的所有数据集均包含在文章材料中。根据要求，他们将毫无保留地提供支持本文结果的原始数据。资金支持
本研究部分得到了河北省国际科技合作项目（25296601D）、中国国家重点研发计划（2021YFD1800500）以及中非合作项目的资助。利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：丁耀忠和张杰表示得到了兰州兽医研究所的财务支持。如果还有其他作者，他们也声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
我们感谢兰州兽医研究所的实验室设备和仪器管理部门的支持，同时也感谢提供SVS序列资源的团队。
