纤连蛋白可变剪接调控EDA外显子通过ITGB1/FAK/Src/RUNX2通路促进动静脉内瘘动脉瘤样扩张的机制研究

《Renal Failure》：Splicing of fibronectin gene contribute to the aneurysmal dilatation of arteriovenous fistula

本综述创新性地揭示了动静脉内瘘动脉瘤样扩张（AVFA）的新机制：剪接因子SRSF5通过促进纤连蛋白（FN）外显子EDA的异常包含，生成EDA-FN异构体。EDA-FN通过增强与整合素β1（ITGB1）的结合，激活FAK/Src信号轴，进而促进转录因子RUNX2的核转位与活性，最终诱导血管平滑肌细胞（VSMC）向合成表型转换及细胞外基质（ECM）重塑（胶原沉积、弹性蛋白降解），导致血管机械强度下降和AVFA形成。该研究为AVFA的防治提供了潜在新靶点。

　　

引言

终末期肾病患者常需建立动静脉内瘘（AVF）以进行血液透析。然而，近40%的患者术后会发生动静脉内瘘动脉瘤样扩张（AVFA），导致穿刺点出血时间延长、感染风险增加，甚至可能破裂。尽管发病率高，但针对AVFA的研究仍非常有限。动脉瘤样扩张涉及细胞外基质（ECM）重塑和血管平滑肌细胞（VSMC）向合成表型的转换。纤连蛋白（FN）是ECM的关键成分，其III型结构域包含三个可变剪接位点：EDA、EDB和IIICS。其中，EDA片段由外显子33编码，具有高度保守性。在大多数成人组织中，野生型FN（WT-FN）不包含EDA结构域，而包含EDA结构域的EDA-FN在炎症、肿瘤和血管病变中表达上调。本研究旨在探讨EDA-FN在AVFA形成中的作用及机制。

材料与方法

本研究收集了27例临床样本（14例正常AVF，13例AVFA），所有操作均符合上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会标准。分离培养原代VSMC，进行RNA测序（RNA-seq）和可变剪接事件分析。通过CRISPR/Cas9技术构建FN基因敲除的VSMC，并利用慢病毒感染构建稳定表达WT-FN或EDA-FN的VSMC系。采用定量PCR（qPCR）、Western blotting、RNA原位杂交、免疫荧光、Masson染色、弹性蛋白Van Gieson（EVG）染色、细胞迁移（划痕实验）和增殖（EdU、CCK-8）实验、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫沉淀（ChIP）、RNA免疫沉淀（RIP）、RNA Pull-down等多种分子和细胞生物学技术进行机制探索。统计分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行。

结果

AVFA来源的VSMC中EDA包含增加

RNA-seq分析发现，与AVF组织相比，AVFA组织中存在显著的可变剪接事件，其中外显子跳跃（SE）最为常见。对FN基因的分析显示，AVFA组织中EDA外显子的包含比例显著增加。DNA电泳、qPCR、Western blotting及RNA原位杂交均证实，AVFA组织及分离的原代VSMC中EDA-FN的mRNA和蛋白水平升高，而WT-FN水平下降。EDA包含比例与血管直径呈正相关。免疫荧光显示EDA-FN与VSMC标志物Myh-11共定位，表明EDA-FN在VSMC中异常表达。

EDA-FN诱导VSMC表型转换和ECM改变

组织学染色（Masson、EVG）显示，AVFA组织中出现显著的胶原沉积和弹性蛋白降解，且其程度与EDA包含水平相关。体外实验表明，与表达WT-FN的VSMC相比，表达EDA-FN的VSMC表现出合成表型标志物Vimentin（VIM）上调、收缩表型标志物SM-22α下调、胶原蛋白COL1A1和基质金属蛋白酶MMP2表达增加、弹性蛋白（ELN）减少、MMP活性增强，以及增殖和迁移能力显著提升。

EDA-FN通过ITGB1/FAK/Src通路激活RUNX2

免疫共沉淀实验表明，EDA-FN与整合素β1（ITGB1）的结合亲和力强于WT-FN。Western blotting显示EDA-FN能显著增强FAK和Src的磷酸化。使用ITGB1 siRNA或FAK抑制剂Defactinib处理，可有效逆转EDA-FN诱导的ECM重塑和表型转换。进一步研究发现，EDA-FN能上调转录因子RUNX2的表达，促进其核转位，并增强其与MMP2启动子的结合能力。FAK抑制剂Defactinib可抑制RUNX2的上调和转录活性。

SRSF5促进EDA外显子包含

利用荧光报告基因系统筛选剪接因子，发现SRSF5的敲低对减少EDA包含的影响最显著。qPCR和Western blotting证实AVFA组织和其来源的VSMC中SRSF5表达上调。在VSMC中过表达SRSF5，可导致EDA包含增加，并引发与EDA-FN过表达类似的ECM重塑和VSMC合成表型转换。通过生物信息学预测和实验验证（RIP、RNA Pull-down），发现SRSF5与FN前体mRNA上第32和33号外显子之间的内含子区域（位点#1）结合，从而促进EDA外显子的包含。使用反义RNA阻断该结合位点可有效降低EDA的包含。

讨论

本研究首次揭示了剪接因子SRSF5/FN可变剪接（EDA包含）/ITGB1/FAK/Src/RUNX2信号轴在AVFA发生发展中的关键作用。EDA-FN通过强效激活整合素信号，驱动VSMC表型转换和ECM病理性重塑，削弱血管壁机械强度，最终导致动脉瘤样扩张。血流动力学异常可能是诱导SRSF5上调的重要因素。靶向SRSF5或EDA-FN/ITGB1相互作用，或干预下游信号通路，可能为预防AVFA提供新的治疗策略。值得注意的是，血管钙化相关因子RUNX2的激活，结合血液透析患者固有的钙磷代谢紊乱，提示血管钙化可能在AVFA进程中扮演重要角色。

结论

AVFA中SRSF5表达上调，通过促进FN基因EDA外显子的包含，增加EDA-FN的产生。EDA-FN通过增强与ITGB1的结合，激活FAK/Src/RUNX2信号通路，诱导VSMC合成表型转换和ECM重塑，最终导致动静脉内瘘动脉瘤样扩张的形成。