《Research》：Protective Efficacy of a Hemagglutinin-Based mRNA Vaccine Against H5N1 Influenza Virus Challenge in Lactating Dairy Cows
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为应对高致病性禽流感H5N1病毒在奶牛中的传播及人畜共患风险，研究人员开发了一种基于血凝素(HA)的mRNA-脂质纳米颗粒(LNP)疫苗。该研究评估了疫苗在泌乳奶牛中的安全性、免疫原性及保护效果。结果表明，疫苗安全性良好，不影响产奶量，并能诱导强烈的抗体反应。二次免疫后两周，所有接种奶牛均能完全抵御高剂量H5N1病毒攻击；即使在首免后第19周血清抗体水平极低时，仍有三分之二个体获得完全保护。此研究为mRNA疫苗用于控制奶牛H5N1感染及减少溢出风险提供了重要依据。
高致病性禽流感H5N1病毒自2024年3月在美国奶牛中首次检出后，迅速蔓延至18个州的1080多家牧场，并导致41例人感染，对畜牧业和公共卫生构成严重威胁。病毒尤其擅长侵袭乳腺组织，主要通过奶牛间的“口-乳头”接触传播，造成乳腺损伤和产奶量下降。更令人担忧的是，从病牛和奶厂工人体内分离的病毒株中已发现PB2-627K、PB2-701N等可增强人类致病性的突变，这凸显出开发高效疫苗的紧迫性。
为应对这一挑战，研究人员将目光投向已在新冠疫情防控中证明其价值的mRNA技术平台，开发了一种编码clade 2.3.4.4b H5病毒血凝素(HA)蛋白的mRNA-脂质纳米颗粒(LNP)疫苗，并系统评估其在泌乳奶牛这一关键目标群体中的效果。相关成果发表于《Research》期刊。
研究采用的主要技术方法包括：利用体外转录合成经核苷修饰的mRNA，并将其封装于由可电离脂质、胆固醇等组成的LNP中制成疫苗；选用来自当地牧场的3-5岁泌乳荷斯坦奶牛进行免疫（500 μg剂量，间隔3周免疫两次）和攻毒实验；通过病毒滴定（鸡胚法）、血清学检测（血凝抑制HI试验、病毒中和NT试验）及组织病理学分析（H&E染色、免疫组化IHC）等手段综合评价疫苗的安全性、免疫原性及保护效力。
安全性及免疫原性
疫苗在奶牛中耐受性良好，接种后奶牛体温、采食及日产奶量均与未接种对照组无差异（图1A）。免疫后，免疫球蛋白G(IgG)成为血清和乳汁中的主要抗体类型（图1B, C）。首免后3周即可检测到血清HI（滴度8-128）和NT抗体（滴度32-128）；加强免疫后1周，抗体水平显著升高，随后逐渐下降（表1）。乳汁NT抗体动态与血清相似，但于免疫后15周降至检测限以下；至第19周时，部分奶牛血清中仍可检测到HI和NT抗体。
疫苗保护效力
在二次免疫后2周（即首免后5周）进行攻毒试验。未接种奶牛攻毒后出现发热（图2A），接种病毒乳区所产乳汁变黄、呈初乳样（表2），并在鼻拭子、唾液及乳汁中持续检测到病毒排出（图3A-C）。在攻毒后第3、6天处死的对照奶牛多个组织（如鼻甲、舌根、支气管、肺叶及接种乳区）中均检测到病毒复制（图3D, E）。相比之下，接种疫苗奶牛无发热、乳汁正常，所有样本均未检测到病毒（图3, 图S1B），表明疫苗提供了完全保护。
长效保护效力
在首免后第19周（此时乳汁NT抗体已无法检测，血清抗体水平很低）进行攻毒。未接种对照组依然出现发热（图2B）、乳汁异常及多组织病毒复制（图4, 图S2A）。接种疫苗组中，有2头奶牛获得完全保护，其鼻拭子、唾液、乳汁及组织样本均未检测到病毒（图4A-C, E, 图S2B）；另1头奶牛在攻毒后第3天处死时，在其鼻拭子、唾液、高剂量接种乳区、气管及部分肺叶中检测到较低水平的病毒（图4A-D），但这些乳区乳汁外观正常（表2），提示损伤较轻。值得注意的是，完全保护的2头奶牛其血清HI和NT抗体滴度分别仅为8/16和16。
组织学研究
未接种奶牛肺组织呈现肺泡和细支气管腔被中性粒细胞、巨噬细胞及坏死细胞碎片严重阻塞，伴支气管上皮细胞坏死脱落（图5A），乳腺组织则见大量中性粒细胞浸润及肺泡上皮细胞坏死脱落（图5B），并检测到病毒抗原（图5C, D）。接种疫苗奶牛在5周攻毒后，肺和乳腺均未见明显病理变化和病毒抗原（图5E-H）。在19周攻毒后第3天处死的接种奶牛肺组织出现间质水肿和轻度炎性细胞浸润（图5I），高剂量接种乳区有局部轻度中性粒细胞浸润（图5J），肺中未检出病毒抗原，但乳区有少量抗原阳性细胞（图5K, L）；而第6天处死且未检出病毒的接种奶牛，其组织无病理变化和病毒抗原（图5M-P）。
攻毒后抗体快速应答
对19周攻毒的奶牛监测发现，未接种奶牛乳汁NT抗体在攻毒后第10天才被检测到（图6B），而接种奶牛在攻毒后第1天乳汁NT抗体即迅速上升，第6天可达10 log2（图6A, B），血清NT抗体滴度也于第6天超过10 log2（图6C），显示出强烈的记忆性免疫应答。
结论与意义
本研究证实，基于HA的H5 mRNA-LNP疫苗对泌乳奶牛安全，能诱导强大且持久的抗体反应，并提供针对H5N1病毒攻击的坚实保护。特别重要的是，即使在血清抗体水平较低时，疫苗仍能激发快速的记忆性反应，有效清除病毒。研究确定了血清HI/NT抗体滴度16可能作为奶牛是否需要加强免疫的参考阈值。该成果不仅为控制奶牛场H5N1疫情提供了除灭活疫苗和DNA疫苗外的又一有效工具（mRNA疫苗），也为降低其 zoonotic spillover（人畜共患传播）风险奠定了坚实基础，对保障畜牧业生产和公共卫生安全具有重要战略意义。
