CRISPR/Cas12a驱动的电化学生物传感器，用于超灵敏检测海鲜样本中的副溶血性弧菌

《Analytica Chimica Acta》：CRISPR/Cas12a empowered electrochemical biosensor for ultrasensitive detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples

建立基于PCR和发夹DNA探针的电化学CRISPR生物传感器，用于高灵敏度检测副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）。通过PCR扩增目标DNA，结合CRISPR/Cas12a系统的转切割效应和电化学信号检测，实现检测限达1.17拷贝/μL（DNA）、12.3 CFU/g（人工污染虾样），与实时荧光定量PCR检测结果高度一致。发夹DNA探针设计有效克服了空间位阻问题，显著提升Cas12a的转切割效率。该技术兼具快速性、高灵敏度和现场适用性，为复杂食品基质中V. parahaemolyticus检测提供新方案。

　　

李永芳|陈轩|杨哲勋|王志军|王瑞

佛山大学食品科学与工程学院，中国佛山，528231

摘要

快速且超灵敏地检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称Vp）对于早期预防食源性疾病具有重要意义。传统的Vp检测方法耗时较长，灵敏度和特异性较低。本研究将CRISPR/Cas12a系统与电化学传感技术和聚合酶链反应（PCR）结合，开发了一种基于PCR的E-CRISPR生物传感器用于Vp的检测。从Vp中提取的目标DNA通过PCR扩增后，激活CRISPR/Cas12a系统在电极上切割甲基蓝（MB）标记的发夹DNA探针，从而产生显著的电电流变化。使用发夹DNA探针可以减少Cas12a切割过程中的空间阻碍，提高切割效率和传感性能。在最佳条件下，检测限分别达到1.17拷贝/μL（基因组DNA）、1.23 CFU/mL（标准细菌）和12.3 CFU/g（人工污染的虾样本）。此外，基于PCR的E-CRISPR生物传感器具有优异的重现性和特异性。最重要的是，该生物传感器在18个海产品样本的检测结果与实时定量PCR结果完全一致，证实了其在复杂食品基质中监测Vp的广泛适用性。我们开发的E-CRISPR生物传感器是一种简单、快速且超灵敏的Vp检测方法，也可用于其他食源性病原体的检测。

引言

副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus，简称Vp）是导致水产品食源性疾病爆发的主要致病菌。食用受污染的海产品可能导致食物中毒、严重的胃肠道疾病，甚至危及生命[1]、[2]、[3]。据统计，2013年至2022年间中国共有23818例由Vp引起的食源性疾病病例，患者年龄从2个月到100岁不等，多数病例发生在夏季的沿海地区[4]。鉴于Vp的强增殖能力，快速且超灵敏地检测海产品中的Vp对于早期预防病原体感染至关重要。传统的Vp检测方法包括金标准培养法、免疫测定法和基于聚合酶链反应（PCR）的分子诊断方法。培养法劳动强度大且耗时较长[5]，从取样到得出结果需要3-5天，并且需要特定的培养条件。免疫测定法（如侧向流动免疫测定法）操作简便、快速且成本低廉，但灵敏度不足，存在漏检风险[6]。实时定量PCR（qPCR）灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业操作人员，限制了其在资源有限地区的实际应用[7]。因此，迫切需要开发一种快速、超灵敏、特异性强且可在现场使用的Vp检测方法。

成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（CRISPR/Cas）系统因其单碱基识别特异性和高效率的切割活性而在核酸检测中受到广泛关注[8]、[9]。Cas12a-crRNA复合物能够识别含有PAM序列（TTTN）的双链DNA（dsDNA）。crRNA识别目标后，Cas12a被激活并切割目标DNA（顺式切割），同时无差别地切割附近的单链DNA（ssDNA）（反式切割）[10]、[11]。由于Cas12a的切割速度高达每秒1250次[12]，CRISPR/Cas12a系统具有信号放大的功能。快速的信号转导和易于操作的特点使其成为理想的现场检测工具。大多数基于CRISPR的生物传感技术依赖于荧光报告基因或侧向流动条。然而，这些方法的定量检测需要昂贵的荧光读数设备，降低了实际应用的便利性。因此，需要一种简单的读数方法来增强CRISPR/Cas系统的实用性和功能性。

电化学传感技术具有高灵敏度、数值读数和易于微型化的优势[13]。Dai等人[14]首次将电化学报告基因探针固定在电极表面，开发出基于CRISPR/Cas12a的电化学传感器（E-CRISPR）。CRISPR切割后报告基因探针的数量变化可以通过电流变化来读取，从而实现信号转导和定量检测[15]。然而，E-CRISPR在食品安全监测中的应用仍面临一些挑战。首先，大多数已开发的E-CRISPR传感器不依赖扩增[16]、[17]、[18]，其灵敏度通常在fM级别，无法满足复杂食品基质中微量目标物质的超灵敏检测要求[19]、[20]。其次，电极上Cas蛋白与电化学报告基因之间的空间阻碍限制了Cas12a的切割效率，从而降低了检测灵敏度[21]、[22]。因此，迫切需要开发具有更高检测灵敏度的E-CRISPR生物传感器以适应多样的食品样本基质。

本文开发了一种基于PCR的快速E-CRISPR生物传感器用于Vp检测。首先使用两温度控制的快速PCR扩增Vp的基因组DNA，然后扩增产物激活CRISPR/Cas12a系统在电极上进行切割。PCR和CRISPR/Cas12a的双重扩增确保了高检测灵敏度。此外，使用发夹DNA探针提高了Cas12a的切割效率。所开发的E-CRISPR生物传感器能够在实际虾样本中检测到Vp，最低检测限为12.3 cfu/g，符合中国对预包装水产品中Vp检测的食品安全标准。我们提出的方法为食品安全应用中的快速超灵敏细菌检测提供了新的解决方案。

试剂和材料

本研究中使用的所有DNA和RNA寡核苷酸均由Sangon Biotech（上海）有限公司合成。具体序列列于表S1中。重组RNase抑制剂和SpeedSTAR HS DNA聚合酶购自TaKaRa Bio。LbaCas12a（Cpf1）购自Haihexi Biotechnology（上海）有限公司。四氯金酸（HAuCl₄）、6-巯基-1-己醇（MCH）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆）、铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆）和氯化钾（KCl）也用于实验。

基于PCR的E-CRISPR生物传感器检测Vp的原理

基于PCR和发夹DNA探针的E-CRISPR生物传感器检测Vp的超灵敏原理如图1所示。从虾样本中提取Vp的基因组DNA后，通过PCR扩增获得大量目标dsDNA。将甲基蓝（MB，3’端）和硫醇基团（5’端）标记的发夹DNA探针通过Au-S键固定在AuNPs修饰的SPCE上。在Vp存在的情况下，crRNA识别目标DNA并激活Cas12a。

结论

本研究成功开发了一种基于PCR和发夹DNA探针的CRISPR电化学生物传感器，用于超灵敏检测副溶血性弧菌。通过PCR获得大量目标产物，发夹DNA探针显著提高了Cas12a的切割效率，从而大大提升了CRISPR电化学生物传感器的灵敏度。在优化条件下，该传感器对基因组DNA和标准细菌的检测限达到了理想水平。

CRediT作者贡献声明

李永芳：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法设计、资金申请、数据分析、概念构建。陈轩：撰写 – 初稿撰写、数据分析。杨哲勋：实验研究。王志军：实验研究。王瑞：撰写 – 审稿与编辑、验证、资金申请

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的利益冲突。

数据可用性

数据可根据合理请求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了佛山大学高层次人才科研启动基金和国家自然科学基金（项目编号：32371521）的支持。