《Applied and Environmental Microbiology》：The critical role of hcpR in regulating nitrosative stress defense in Clostridioides difficile
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本研究揭示转录调控因子hcpR通过激活hcp-frdX基因簇介导艰难梭菌（Clostridioides difficile）对活性氮物种（RNS）的防御，其失活导致菌株对一氧化氮（NO）敏感性增加8倍，并引发丁酸代谢重编程及TcdA/TcdB毒素（↑2.4倍）的异常高表达，为理解厌氧病原菌应激适应与毒力调控的关联机制提供新视角。
摘要
Clostridioides difficile（艰难梭菌）是一种厌氧产毒病原菌，定植于宿主胃肠道。在这一恶劣环境中，细菌面临包括活性氮物种（reactive nitrogen species, RNS）在内的多种应激源，RNS诱导的硝化应激（nitrosative stress）必须被有效缓解以确保细菌存活。本研究旨在阐明艰难梭菌防御硝化应激的分子机制。研究人员利用NO供体对流行株R20291的转座子（transposon, Tn）突变体库进行筛选，鉴定出一个对硝化应激敏感的突变体，其hcpR基因（CDR20291_2076）被破坏。hcpR属于Crp/Fnr家族转录调控因子。通过转录组学和代谢组学分析，结合对关键毒力因子——毒素产生的评估，研究结果显示hcpR对艰难梭菌的硝化应激适应至关重要，hcpR::Tn突变体对NO的敏感性增加了八倍。该突变体对其他RNS也表现出敏感性，但对活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）不敏感。RNA测序（RNA-seq）分析表明，hcpR调控参与NO解毒的hcp基因（hybrid-cluster protein）以及铁硫结合蛋白基因frdX（ferredoxin-like iron-sulfur binding protein）。单独敲低hcp和frdX均赋予与hcpR失活突变体相似的NO敏感性。对hcpR::Tn转录组的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析显示，与丁酸代谢（butanoate metabolism）相关的基因表达上调。此外，hcpR::Tn菌株的TcdA/TcdB毒素水平较野生型（wild type, WT）显著升高。靶向代谢组学揭示，hcpR失活导致代谢重塑，转向增强的氨基酸发酵和短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）产生增加，包括丁酸（butyrate）。这些发现证明hcpR是艰难梭菌硝化应激防御的关键调控因子，并通过代谢重塑参与毒力调控。
重要性
在宿主胃肠道内，艰难梭菌 encounter 多种有毒化合物，包括诱导硝化应激的RNS。为在这一恶劣环境中生存，细菌必须对这些损伤性物质建立有效的防御。本研究中，研究人员鉴定出转录调控因子hcpR是艰难梭菌抵御硝化应激的关键因素。缺乏完整hcpR的突变体，或其下游靶点hcp和frdX的敲低，均表现出对RNS的敏感性增加，证实了它们在硝化应激适应中的作用。hcpR突变体还产生显著更高水平的毒素（TcdA/TcdB），突显了其对毒力的影响。此外，该突变体表现出显著的代谢变化，包括SCFAs（如丁酸）的产生增加，而丁酸已知可增强毒素产生。总之，这些发现强调了hcpR作为重要的硝化应激防御调控因子，通过协调的代谢和转录反应连接应激适应与毒力调节。
引言
艰难梭菌是一种定植于人和动物胃肠道（特别是结肠）的厌氧细菌病原菌。它是医疗相关性腹泻的主要原因，可进展为结肠炎——结肠的严重炎症。在宿主肠道环境中，艰难梭菌暴露于一系列应激源，包括宿主免疫反应产生的活性化合物，如RNS和ROS，以及pH、氧气水平和营养可用性的波动。其中，升高的RNS水平施加硝化应激，这是艰难梭菌必须克服才能生存的挑战。
病原菌和环境细菌必须适应化学恶劣条件。特别是硝化应激，源于RNS（如宿主诱导型NO合酶产生的一氧化氮（nitric oxide, NO）以及超氧化物与NO反应形成的过氧亚硝酸盐（peroxynitrite, ONOO））水平的增加。这些活性物种破坏基本细胞功能，导致DNA损伤、脂质过氧化和最终细胞死亡。为对抗这些效应，许多细菌进化出专门的防御机制。例如，大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella sp.）表达hmp基因，该基因编码黄素血红蛋白（flavohemoglobin），在有氧条件下将NO解毒为硝酸盐，或在厌氧条件下转化为一氧化二氮（NO）。其他系统包括调控蛋白，如大肠杆菌中的NO还原酶调控因子NorR，以及存在于天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）等物种中的NO响应转录抑制因子NsrR。
另一个主要的硝化应激调控防御系统是HcpR转录因子，已在环境和病原厌氧菌中鉴定，如脱硫弧菌（Desulfovibrio spp.）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）。在这些生物中，hcpR不仅促进细菌在硝化应激下的存活，还与增强的毒力相关。
研究表明，艰难梭菌拥有应激防御响应机制，使其能够承受各种环境挑战。其中一种机制涉及替代sigma因子σ（sigB），这是革兰氏阳性细菌中的一般应激调控因子。sigB调节对包括氧气张力、RNS、ROS、酸化、阳离子抗菌肽和抗生素暴露等多种应激源的防御。尽管有这些见解，艰难梭菌用于对抗RNS的具体系统在很大程度上仍未被探索。
在本研究中，研究人员通过遗传筛选鉴定出艰难梭菌中的转录调控因子hcpR。其失活增加了对硝化应激的敏感性，并在NO暴露时引起显著的转录扰动。功能分析证明，hcpR特异性介导对RNS的抗性，而非ROS。此外，hcpR失活导致毒素产生升高，伴随以SCFAs（包括丁酸）水平增加为特征的代谢转变。这些发现表明，hcpR在硝化应激防御和代谢重塑中发挥核心作用，可能对艰难梭菌毒力因子的调节产生影响。
结果
hcpR保护艰难梭菌免受硝化应激
研究人员首先通过测定NO供体二乙烯三胺/NONOate（diethylenetriamine/NONOate, DETA/NO）对高毒力流行株R20291的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）评估艰难梭菌对硝化应激的耐受性；MIC发现为1 mM。随后，在对源自R20291菌株的约2,800个转座子突变体的无序文库进行筛选以鉴定对各种应激（包括硝化应激）敏感或耐药的突变体时，发现大多数突变体对DETA/NO仅表现出适度的两倍敏感性增加。然而，一个突变体表现出惊人的八倍敏感性增加，MIC为0.125 mM，而R20291野生型（WT）的MIC为1 mM。由于其对NO供体的高度敏感性，研究人员聚焦于该突变体。全基因组测序鉴定出ermB盒在基因CDR20291_2076中的单一插入，位于R20291基因组的2,431,817位（对应编码序列729个核苷酸中的第641位），导致基因失活。CDR20291_2076被注释为推定的cNMP结合调控蛋白，NCBI中的结构域分析显示其属于Crp/Fnr转录调控因子家族。根据PaperBLAST并通过NCBI中的BLAST搜索确认，该蛋白与牙龈卟啉单胞菌的HcpR（27%同一性）和脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris）的HcpR（26%同一性）以及脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）的HcpR2（34%同一性）具有同源性。研究人员发现CDR20291_2076确实在RegPrecise中被注释为hcpR。因此，研究人员将CDR20291_2076重新注释为hcpR，并将其Tn突变体命名为hcpR::Tn。
生长曲线测定显示，在没有NO供体的正常条件下，WT和hcpR::Tn菌株生长相似。然而，在硝化应激下，WT菌株耐受高达0.125 mM的DETA/NO。相比之下，hcpR::Tn即使在0.0625 mM下也无法生长，表明hcpR失活损害了NO耐受性。为确认对硝化应激的敏感性增加是特异性由于hcpR失活并排除极性效应，研究人员用处于其天然启动子下的完整hcpR基因对hcpR::Tn突变体进行互补。这种互补恢复了hcpR::Tn对NO供体的耐受性，MIC恢复到1 mM，与WT空载体（empty vector, EV）菌株相当。研究人员进一步使用CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）进行hcpR敲低。在0.0625 mM DETA/NO下，WT EV对照显示出与二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）对照相当的生长。相比之下，hcpR敲低菌株（hcpR-kd）在相同浓度下表现出生长受损，在WT EV耐受的0.125 mM下无法生长。这些结果证明hcpR是艰难梭菌适应硝化应激所必需的。
hcpR在硝化应激期间的转录调控
为研究hcpR在艰难梭菌中在无应激和硝化应激条件下的调控作用，研究人员进行了转录组分析，比较WT和hcpR::Tn菌株。在无应激条件下，相对于WT，hcpR::Tn菌株中有24个显著差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），不包括失活的hcpR基因。几个最上调的基因根据KEGG通路分析与丁酸代谢相关。下调的基因包括hcp、CDR20291_2075（基于RegPrecise重新注释为frdX，一种铁氧还蛋白样铁硫结合蛋白）以及与果糖和甘露糖代谢相关的基因。为在这些DEGs中鉴定hcpR的潜在直接靶点，研究人员使用FIMO（MEME Suite）分析了具有来自RegPrecise的HcpR结合基序的其启动子区域。仅在frdX-hcp基因对的上游鉴定出一个推定结合位点，该基因对与hcpR共定位，表明hcpR通过共享的上游启动子直接调控这些基因。
在硝化应激下，研究人员通过比较NO处理的WT和NO处理的hcpR::Tn菌株（各自相对于未处理的WT）的转录组来评估hcpR的作用。WT表现出适度的响应，有42个DEGs（约基因组的1.2%），而hcpR::Tn表现出广泛的转录破坏，有1,481个DEGs（约基因组的42%）。NO处理的hcpR::Tn和NO处理的WT菌株的比较显示，在硝化应激下，有1,350个基因因hcpR失活而独特地差异表达。使用严格截止值（p.adjust < 0.05）对KEGG通路进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）鉴定出显著富集的多个代谢通路。上调基因在精氨酸/脯氨酸和碳代谢（不包括主要受hcpR失活影响的丁酸代谢）中富集。相比之下，下调基因在核糖体功能、鞭毛组装、细菌趋化性和肽聚糖生物合成中强烈富集。使用放宽的阈值（q ≤ 0.25）揭示了额外的富集通路，包括在上调基因中的甘油磷脂和烟酸/烟酰胺代谢，以及下调基因中的氨基酸和脂肪酸生物合成通路。这些结果表明，hcpR失活在硝化应激期间广泛影响代谢和结构过程。
在NO处理的hcpR::Tn和NO处理的WT菌株之间共享的基因中，只有hcp和frdX被鉴定为hcpR的直接靶点。两个基因在WT菌株中在硝化应激下被强烈诱导，但在hcpR::Tn突变体中未被诱导。定量PCR（quantitative PCR, qPCR）证实了这一趋势；在WT中，hcp和frdX分别上调约206 ± 26倍和220 ± 79倍。相比之下，它们在突变体中的表达分别降低约5 ± 1倍和9 ± 3倍。为研究frdX-hcp基因簇在硝化应激防御中的作用，研究人员单独敲低了hcp和frdX。在硝化应激下，两个敲低菌株与无应激对照相比均表现出生长受损。阴性对照，敲低nimB（一个在本研究使用的NO水平下不已知对NO解毒有贡献的基因），不受NO暴露影响。总之，这些发现证明hcpR失活在硝化应激下导致广泛的转录失调，并且它在响应NO时激活frdX-hcp簇。
hcpR保护免受硝化应激而非氧化应激
基于观察到的hcpR::Tn突变体对NO的敏感性，研究人员检查了其对其他硝化应激源的反应。具体而言，hcpR::Tn对过氧亚硝酸盐（ONOO）表现出八倍敏感性增加，MIC为0.5 mM，而WT菌株为4 mM。hcpR的互补恢复了突变体的耐受性，将MIC增加到2 mM。该突变体还对亚硝酸盐（NO）表现出16至32倍的敏感性增加，MIC值为0.125至0.25 mM，而WT菌株保持4 mM的MIC。用完整hcpR的互补同样逆转了这种敏感性，将MIC值恢复到4-8 mM，与WT相似。为确定hcpR是否有助于氧化应激防御，将WT和hcpR::Tn菌株暴露于ROS，包括甲萘醌（menadione，一种超氧化物产生剂）和过氧化氢（HO），后者产生羟基自由基。两个菌株对甲萘醌和HO表现出相似的敏感性，MIC分别约为0.0156和0.25 mM。在HO诱导应激下的生长测定证实，两个菌株在0.25 mM下经历相同的生长抑制，在低于此浓度下生长恢复。总之，这些结果揭示hcpR特异性介导艰难梭菌中的硝化应激防御，但不调节对氧化应激的防御。
hcpR不介导对MTZ诱导应激的防御
甲硝唑（metronidazole, MTZ）是一种对艰难梭菌有效的硝基杂环抗生素，被认为通过产生模拟硝化应激的细胞毒性硝基自由基中间体发挥其杀菌作用。为研究hcpR是否影响MTZ敏感性，研究人员比较了WT和hcpR::Tn菌株对MTZ的敏感性。两个菌株显示出相似的MIC，为0.125-0.25 μg/mL。生长曲线显示出相似的响应，两个菌株在4 μg/mL MTZ下被抑制，在较低浓度下生长减少。为进一步探索MTZ与NO介导的硝化应激防御之间的关系，研究人员分析了先前发表的RNA-seq数据，比较了MTZ处理和NO处理的WT艰难梭菌R20291的转录组。MTZ暴露导致495个DEGs，而NO暴露仅影响42个DEGs。两种处理之间有12个DEGs共享。此外，已知的hcpR靶基因hcp和frdX在NO处理中上调最强（分别约420倍和152倍），但在MTZ处理中仅适度诱导（分别约6倍和4倍）。这些发现表明hcpR不太可能在艰难梭菌中对抗MTZ诱导的毒性或其相关硝基自由基中间体的防御中发挥主要作用。
hcpR调节艰难梭菌毒素产生
硝化应激防御机制已与细菌毒力相关联。为评估hcpR失活对毒素毒力因子的影响，研究人员对毒素产生进行了定量。hcpR::Tn突变体产生的毒素（TcdA/TcdB）水平比WT菌株高约2.4倍。为进一步验证这一观察，研究人员检查了携带EV或互补构建体的hcpR::Tn菌株中的毒素水平。携带EV的hcpR::Tn维持升高的毒素产生，而引入完整的hcpR基因将毒素水平恢复到WT EV菌株中观察到的水平。研究人员进一步使用qPCR定量了tcdA和tcdB毒素基因的表达水平。在hcpR::Tn EV菌株中，tcdA和tcdB的表达均显著高于WT EV菌株。相比之下，在hcpR::Tn + hcpR互补菌株中，这些升高的表达水平恢复到WT EV水平。
鉴于丁酸代谢基因在hcpR::Tn转录组中上调，并且考虑到增加的丁酸水平已知可增强毒素产生，研究人员调查了突变体菌株中SCFA代谢物是否升高。靶向代谢组学证实，在hcpR::Tn突变体中，包括丁酸、异丁酸（isobutyrate）和2-甲基丁酸（2-methylbutyrate）在内的SCFAs水平增加。同时，支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAAs）如缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）的水平降低。总之，这些发现表明hcpR影响艰难梭菌毒素产生，并导致影响SCFA水平的代谢变化。
讨论
在宿主胃肠道中，艰难梭菌暴露于由升高的RNS引起的硝化应激，这些RNS是有害的，必须被对抗以确保细菌存活。在本研究中，研究人员证明hcpR（hcpR::Tn）的失活增加了艰难梭菌对多种RNS的敏感性，包括NO、ONOO和NO，后者是一种已知有助于RNS产生的相关氮代谢物。这些发现与先前关于脱硫弧菌和牙龈卟啉单胞菌中HcpR介导的硝化应激防御的报道一致，这些细菌分别栖息于环境和口腔生态位。hcpR的失活使这些细菌在升高的亚硝酸盐或S-亚硝基谷胱甘肽存在下对硝化应激敏感。总之，这些结果描绘了一幅hcpR介导的硝化应激防御是一种在不同细菌物种和生态位中保守的生存策略的画面。数据显示hcpR特异性赋予对RNS的保护，而非ROS，这与牙龈卟啉单胞菌中的观察一致。这种功能特异性可能可以通过艰难梭菌编码专门的ROS防御系统（包括过氧化物应激调控因子PerR和各种氧化应激解毒酶）这一事实来解释，这些系统可能独立于RNS响应通路运作。这表明艰难梭菌使用不同的调控系统来管理宿主环境中的不同应激。
研究结果显示，hcpR的失活显著重塑了艰难梭菌在硝化应激下的全局转录景观，并证明hcpR对于在硝化应激期间维持转录稳态至关重要，保护代谢和结构过程免受广泛的失调。在硝化应激下，hcpR::Tn突变体表现出增加的氨基酸分解代谢和中心碳代谢，反映了在应激下增加能量产生的尝试。同时，能量密集型过程（包括核糖体生物发生和细胞壁合成）的下调表明向能量守恒的转变。总之，这些变化为hcpR失活驱动的应激适应性代谢重编程提供了见解。
研究人员发现hcpR在响应硝化应激时调控hcp和frdX的表达。这些基因位于hcpR的直接上游，这种基因组排列与脱硫弧菌（如脱硫弧菌Hildenborough和阿拉斯加脱硫弧菌G20）中看到的相似，尽管基因内容有一些变化。WT和hcpR::Tn菌株中hcp和frdX的独特但协调的表达模式，加上共享的HcpR结合位点和相似的硝化应激响应表型，支持它们在艰难梭菌中被hcpR共调控。这种模式与脱硫弧菌Hildenborough中的发现一致。
hcp基因是参与NO解毒的已确立的HcpR靶点。在牙龈卟啉单胞菌中，hcp是主要的HcpR调控基因，对硝化应激适应和细胞内存活至关重要。在大肠杆菌中，hcp的缺失增加了NO敏感性并损害其向一氧化二氮（NO）的还原解毒。类似地，在脱硫弧菌中，NO与Hcp结合，强化了其在NO解毒中的作用。与这些发现一致，研究人员证明艰难梭菌中hcp的敲低增加了对NO的敏感性。尽管数据表明frdX也有助于硝化应激适应，但其确切功能仍不清楚。frdX编码一种通常通过Fe-S簇参与电子转移的铁氧还蛋白样铁硫结合蛋白。可以推测frdX参与hcpR介导的应激防御响应期间的氧化还原调节或电子转移。
hcpR突变体对MTZ表现出相似敏感性的观察表明，hcpR不太可能在艰难梭菌中对抗MTZ的防御中发挥重要作用，而MTZ被认为诱导硝化应激。转录组分析显示，MTZ暴露比NO暴露在WT中引发更广泛和更广泛的转录响应，具有独特的表达谱。此外，hcpR靶基因hcp和frdX被NO强烈诱导，但仅被MTZ适度上调。这些发现表明MTZ和NO引发分离或独特的调控通路来处理这些应激源。对MTZ解毒的细胞响应可能涉及很大程度上独立于hcpR的机制。这很有趣，因为MTZ被认为能够产生诱导硝化应激的反应性硝基自由基。
除了其在应激防御中的作用外，研究结果表明hcpR影响艰难梭菌中的关键毒力因子。hcpR::Tn突变体显示出增加的毒素（TcdA/TcdB）产生，包括转录水平。这种毒力因子是艰难梭菌发病机制的核心，有助于结肠炎症。hcpR::Tn中丁酸代谢基因的表达增加与升高的丁酸水平相关。此外，研究人员观察到其他SCFAs的浓度增加和BCAAs的水平降低，表明增强的BCAA分解代谢
