《Applied and Environmental Microbiology》：Silicate minerals enhance the expression of genes related to mineral dissolution by Priestia aryabhattai strain C4-10
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本研究系统阐述了革兰氏阳性菌Priestia aryabhattai C4-10溶解黑云母和利蛇纹石的生理机制与分子基础。研究发现，C4-10通过产酸（如苹果酸、乙酸、草酸）、分泌铁载体和胞外聚合物（EPS）、细胞吸附及矿物表面生物膜形成等方式显著促进矿物溶解。转录组学分析揭示，矿物存在显著上调了与乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸生物合成、三羧酸（TCA）循环及ABC转运蛋白等相关基因的表达。实时定量PCR（RT-qPCR）进一步验证了七个关键基因（lutA_2、actP、glgC、gtaB_3、02676、levE、glnQ）的表达与Fe/Mg释放浓度呈强正相关，表明这些基因在矿物溶解过程中发挥核心作用。该研究为理解革兰氏阳性菌-矿物互作提供了新视角，在农业养分管理和碳封存方面具应用潜力。
引言
硅酸盐矿物的溶解是地球表面常见的地质过程，对土壤形成与演化、植物营养、元素生物地球化学循环及碳封存至关重要。矿物与微生物之间的相互作用自地球生命出现以来便普遍存在。微生物通过产生有机酸和金属络合配体、改变氧化还原条件以及吸附于矿物表面等方式促进矿物溶解。众多细菌物种已被证实能增强硅酸盐矿物的溶解，其中细菌胞外多糖可能通过形成金属-有机络合物来刺激矿物溶解。尽管对细菌辅助矿物溶解的分子机制已有初步探索，但关于革兰氏阳性菌介导矿物溶解的分子机制仍知之甚少。芽孢杆菌属（Bacillus）中的多个菌株已被重新分类为Priestia属，这些菌株广泛分布于各种环境并具有溶解硅酸盐矿物的能力。然而，调控芽孢杆菌菌株中硅酸盐矿物溶解的分子机制尚不明确，阻碍了对硅酸盐矿物与溶矿芽孢杆菌菌株之间相互作用的全面理解。
矿物溶解菌株的分离
从樟树（Cinnamomum camphora）根际土壤中分离出十株革兰氏阳性耐热细菌菌株（C4-1–C4-10）。接种这些菌株显著提高了黑云母补充培养基中的铁（Fe）和铝（Al）浓度，并降低了培养基的pH值。其中，菌株C4-10释放的Fe和Al浓度最高，因此被选作进一步研究的对象，并通过16S rRNA基因测序和全基因组测序分析鉴定为Priestia aryabhattai。
C4-10对硅酸盐矿物的溶解及相关生理活性
在黑云母补充培养基中，接种C4-10在4至48小时孵育期间显著提高了Fe和硅（Si）浓度，并降低了pH值。C4-10在培养基中的细胞数量在4至12小时增加，随后在16至48小时逐渐下降，而黑云母表面的细胞数量在4至48小时持续增加。细胞相关的Fe含量在12至24小时显著增加。在C4-10接种的培养基中检测到铁载体和EPS的产生，并在孵育24小时后在黑云母表面观察到生物膜形成。此外，与不含黑云母的培养基相比，含有黑云母的C4-10接种培养基中苹果酸、乙酸和草酸的浓度显著升高。
在利蛇纹石补充培养基中，接种C4-10在8至48小时孵育期间显著提高了镁（Mg）和Si浓度，并降低了pH值。C4-10在培养基中的细胞数量在4至16小时增加，随后在20至48小时下降，而利蛇纹石表面的细胞数量在4至16小时增加并在20至48小时保持稳定。细胞相关的Mg含量在12至24小时显著增加。在C4-10接种的培养基中检测到铁载体和EPS的产生，并在孵育24小时后在利蛇纹石表面观察到生物膜形成。这些发现表明，C4-10通过产酸、铁载体和EPS的产生以及细胞在矿物表面的吸附来促进黑云母和利蛇纹石的溶解。
C4-10的基因组特征
对C4-10的全基因组序列进行全面分析，揭示了其与矿物溶解相关的潜在机制。基因预测共识别出5,672个基因。在C4-10基因组中，鉴定出与2-氧化羧酸代谢、TCA循环、乙醛酸和二羧酸代谢、丁酸代谢和磷酸戊糖途径相关的基因，这些基因可能有助于菌株的有机酸代谢。此外，基因组中还含有与脂肪酸生物合成、肽聚糖生物合成以及氨基糖和核苷酸糖代谢相关的基因，这些基因可能负责菌株的细胞壁/膜组分。C4-10菌株的基因组还包含与铁载体群体非核糖体肽生物合成、生物膜形成和ABC转运蛋白相关的基因。C4-10基因组中与酸和铁载体产生、生物膜形成、细胞壁/膜生物合成以及转运蛋白相关的基因和代谢途径可能在菌株的矿物溶解活性中发挥重要作用。
转录组学分析揭示差异表达基因（DEGs）
为了研究C4-10在黑云母溶解过程中基因表达的变化及相关分子机制，对在有黑云母和无黑云母的BHm培养基中培养的菌株进行了比较转录组分析。孵育8小时后，鉴定出1,398个上调基因和1,391个下调基因。上调基因主要涉及氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、能量产生和转换、双组分系统以及脂质转运和代谢。GO分析表明，具有最多DEGs的类别包括催化活性、结合、代谢过程和细胞过程。KEGG分析显示，具有最多DEGs的类别包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、膜转运、能量代谢和信号转导。
DEGs的GO和KEGG富集分析
GO富集分析表明，上调的DEGs显著富集于有机酸、羧酸和氨基酸的生物合成过程，以及催化活性和分子功能。KEGG富集分析显示，上调的DEGs显著富集于多种代谢途径，包括乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸（精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成、丁酸代谢、TCA循环和ABC转运蛋白。这些发现暗示了C4-10在黑云母溶解过程中涉及多个基因和代谢途径的复杂细胞反应。
与黑云母溶解相关的关键代谢途径中的DEGs
富集分析显示，与酸代谢、生物膜形成、细胞壁/膜代谢和转运蛋白相关的代谢途径在C4-10中基因表达水平增加。随后，基于它们与各种矿物溶解相关途径的关联，选择了七个上调的DEGs（lutA_2、actP、glgC、gtaB_3、02676、levE和glnQ）进行进一步分析。这些基因涉及乙二醇酸向乙醛酸的转化（可能与TCA循环和有机酸合成相关）、乙酸分泌、多糖生物合成、UDP连接的肽聚糖组装、葡萄糖酸盐跨膜转运、果糖向1-磷酸果糖的转化以及天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的转运。为了阐明C4-10溶解硅酸盐矿物的分子机制，评估了这七个靶基因在黑云母或利蛇纹石存在下的表达水平。
矿物诱导的靶基因表达通过RT-qPCR分析
为了评估从转录组数据中识别的DEGs的准确性，使用RT-qPCR分析了C4-10中七个选定的DEGs在黑云母或利蛇纹石存在下的表达。在C4-10溶解黑云母的过程中，上述DEGs的相对表达水平在5至9小时之间显著增加，与C4-10加速黑云母释放Fe的时间相吻合。类似地，在C4-10溶解利蛇纹石的过程中，这些DEGs的相对表达水平在4至8小时之间也表现出显著增加，此时C4-10快速从利蛇纹石释放Mg。这些RT-qPCR结果证实了转录组数据，表明黑云母或利蛇纹石对这些基因产生了正向诱导。
矿物诱导的靶基因表达与黑云母和利蛇纹石溶解相关
为了进一步研究七个DEGs（lutA_2、actP、glgC、gtaB_3、02676、levE和glnQ）在C4-10溶解黑云母和利蛇纹石中的作用，评估了矿物溶解过程中Fe或Mg浓度与这些基因相对表达水平之间的相关性。接种C4-10在5至9小时孵育期间显著提高了黑云母存在下的Fe浓度，并在4至8小时孵育期间显著提高了利蛇纹石存在下的Mg浓度。值得注意的是，在Fe浓度与这七个基因的相对表达水平之间以及Mg浓度与这些基因的相对表达水平之间发现了显著的正相关性。这些发现共同强调了这些基因在C4-10溶解黑云母和利蛇纹石过程中的重要作用。
硅酸盐矿物的添加增加了七个靶基因的表达
为了进一步阐明DEGs lutA_2、actP、glgC、gtaB_3、02676、levE和glnQ参与C4-10溶解黑云母或利蛇纹石的过程，测量了这些基因在添加黑云母或利蛇纹石的C4-10中的相对表达水平，并与不含矿物的培养物进行了比较。在黑云母存在下，这七个DEGs的相对表达水平在孵育6小时和8小时后显著上调。在利蛇纹石存在下，C4-10中这些基因的相对表达水平在孵育6小时和8小时后也显著上调。这些发现表明，黑云母和利蛇纹石都能增强C4-10中这七个DEGs的表达，突出了这些基因在C4-10释放黑云母中的Fe或利蛇纹石中的Mg的关键作用。
讨论
本研究结合生理技术和整合多组学方法，阐明了溶矿革兰氏阳性菌P. aryabhattai C4-10对黑云母和利蛇纹石的溶解活性及其分子机制。实验证明，C4-10通过降低pH、产生矿物溶解相关代谢物、细胞吸附以及在矿物表面形成生物膜来增强黑云母和利蛇纹石的溶解。C4-10的基因组包含与有机酸代谢、细胞表面吸附相关的细胞壁和膜组分、铁载体和EPS生物合成以及生物膜形成相关的基因，这些都可能有助于矿物溶解。比较转录组学分析进一步揭示，硅酸盐矿物显著上调了C4-10中与酸代谢、生物膜形成、细胞壁/膜代谢和转运蛋白相关的基因表达，这些基因可能参与该菌株对硅酸盐矿物的溶解。
有机酸、铁载体和EPS可通过与溶液中的离子络合来增强溶解。此外，细菌对矿物的吸附通过提高质子浓度、形成矿物表面离子络合物和催化氧化还原反应来促进矿物溶解。EPS的产生有利于生物膜形成，从而使细胞外部的吸附位点更靠近矿物表面，并产生局部更高浓度的风化剂（如铁载体和酸）。芽孢杆菌菌株通过产生有机酸、铁载体、EPS及其对矿物的吸附来溶解硅酸盐矿物。本研究中，在C4-10的矿物溶解过程中观察到pH下降、铁载体和EPS的产生以及细胞吸附和生物膜在黑云母和利蛇纹石表面形成，表明C4-10通过这些生理活动显著增强了两种矿物的溶解。
目前对矿物溶解分子机制的理解主要基于对革兰氏阴性菌的研究。关于革兰氏阳性菌溶解硅酸盐矿物的分子机制的研究有限。与本研究的其他发现不同，本工作系统地阐明了Priestia属（原芽孢杆菌属）中矿物溶解的多基因调控模式。研究发现，与乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸生物合成、丁酸代谢、TCA循环和ABC转运蛋白相关的基因表达显著上调和代谢途径富集，表明C4-10的矿物溶解过程涉及多个基因和代谢途径的复杂细胞反应。重要的是，在C4-10中鉴定出一组保守的核心基因（lutA_2、actP、glgC、gtaB_3、02676、levE和glnQ），它们在两种矿物系统中均显著上调，并且其表达水平与黑云母或利蛇纹石存在下Fe或Mg的释放呈正相关。上调的基因不仅参与有机酸代谢（如lutA_2和actP），还包括与细胞壁合成（gtaB_3）、多糖生物合成（glgC）和多种物质转运（02676、levE和glnQ）相关的功能。此外，glgC的上调可能与生物膜基质成分的合成密切相关。生物膜形成丰富了矿物界面处的细胞，并可能通过维持具有较高浓度质子和螯合剂的局部微环境来直接促进矿物溶解。本研究中矿物表面的生物膜形成与这些基因的上调表达一致，表明C4-10通过调节细胞壁和储存化合物代谢来优化其附着和集体行为。此外，菌株C4-10中细胞相关的Fe和Mg含量在矿物溶解过程中随时间增加，且与ABC转运蛋白相关的基因被富集，表明C4-10可能增强其对矿物溶解释放的营养物质（如Fe或Mg）的吸收，可能建立了一个正反馈循环。这种结合的“溶解-吸收”策略可能赋予其在营养贫乏的矿物环境中生存的竞争优势。这些发现表明，C4-10的矿物溶解能力源于其代谢状态的全局重编程，而非单一途径的激活。研究结果扩大了对革兰氏阳性溶矿细菌所采用的不同分子机制的理解。最终，这些发现可能具有潜在的应用价值。深入了解细菌溶解硅酸盐的分子机制有助于开发基于微生物的农业养分管理技术和二氧化碳封存策略。C4-10对两种结构不同的含镁硅酸盐矿物的有效溶解表明其可能具有广谱的矿物溶解能力，为利用革兰氏阳性菌从土壤原生矿物释放养分或增强碳封存提供了一种新的候选菌株。
材料与方法
耐热溶矿细菌的分离、硅酸盐矿物、培养基和培养条件、黑云母溶解能力和C4-10的矿物溶解相关生理活性、菌株C4-10的完整基因组测序、样品收集、RNA提取和转录组测序、差异表达基因和功能富集、短期黑云母溶解活性和靶基因表达、黑云母对靶基因表达的影响、利蛇纹石溶解能力、矿物溶解相关生理活性以及C4-10的靶基因表达、统计分析等详细实验方法均按标准流程进行，确保了研究结果的可靠性。
