道路融雪盐对银鲑早期发育的致死与亚致死效应研究

《Aquatic Toxicology》：Road Salt Creates a Slippery Slope for Pacific Salmon: Environmentally Realistic Salt Pulses Have Lethal and Sublethal Effects on Developing Coho Salmon ( Oncorhynchus kisutch)

本研究针对道路融雪盐导致淡水盐化、威胁太平洋鲑鱼生存的问题，通过模拟环境真实浓度的盐脉冲，系统评估了其对银鲑（Oncorhynchus kisutch）不同发育阶段的毒性效应。研究发现，受精后<1小时内的早期盐暴露可导致显著死亡率、离子调节紊乱及畸形率增加，揭示了其发育敏感窗口，为改进道路融冰实践、保护濒危鲑鱼种群提供了关键科学依据。

　　

在加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华低陆平原，冬季道路融雪盐（主要成分为NaCl）的大量使用导致当地溪流受到污染。这些溪流正是太平洋鲑鱼，尤其是银鲑（Oncorhynchus kisutch）的重要产卵地。省级急性水质指南规定氯离子（Cl^-）浓度不得超过600 mg L^-1，然而监测数据显示，道路盐径流产生的盐脉冲浓度可超过该指南值的11倍以上，且持续时间平均超过24小时。更为严峻的是，银鲑的产卵和早期发育期与每年11月至次年3月的盐污染高峰期完全重叠。银鲑本身对污染物和水质变化就较为敏感，其种群数量因栖息地丧失和退化而持续下降。因此，评估道路盐对银鲑早期发育的影响，对于制定有效的保护策略和法规至关重要。本研究论文发表在《Aquatic Toxicology》上。

为了探究道路盐脉冲对银鲑的潜在影响，研究人员设计了一系列实验。他们从孵化场获取了银鲑的卵子和精子，并在三个不同的发育时间点模拟了环境相关浓度（0, 600, 1200, 1800, 2400, 4800 mg L^-1Cl^-）的24小时盐脉冲暴露：受精时（5分钟短时暴露）、受精后<1小时以及50%孵化率时。暴露结束后，将胚胎或仔鱼移回淡水中饲养，直至上浮期（swim-up），以评估其存活率、畸形率、形态变化、离子浓度（Na⁺, Ca²⁺, K⁺）、应激激素（皮质醇）水平以及相关基因表达的变化。

本研究采用的关键技术方法包括：通过静态暴露实验模拟环境盐脉冲；使用图像分析软件（ImageJ）进行胚胎直径、仔鱼长度和卵黄囊体积等形态计量学测量；利用火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定全胚胎/仔鱼的离子浓度；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测皮质醇水平；通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析离子调节、发育、代谢和甲基化相关基因的mRNA表达量。实验所用银鲑配子来自卡皮拉诺河孵化场。

3.1. 存活率

研究发现，在受精时进行5分钟盐暴露对受精成功率和后续至上浮期的存活率均无显著影响。然而，在受精后<1小时开始进行24小时盐脉冲暴露，则对胚胎存活产生了显著影响。当氯离子浓度≥1800 mg L^-1时，存活率开始下降，在2400和4800 mg L^-1Cl^-处理组中，存活率分别降至35.3%和8.6%，显著低于对照组（90.5%）。半数致死浓度（LC₅₀）为2108 mg L^-1Cl^-。值得注意的是，死亡率在盐暴露结束约2.5周后才开始显现，表现为延迟性死亡。相比之下，在50%孵化率时进行盐脉冲暴露，即使最高浓度（4800 mg L^-1Cl^-）也未对上浮期的存活率产生显著影响。此外，研究还发现不同母本家族（雌鱼A-F）对盐胁迫的敏感性存在显著差异，最敏感家族（B）的LC₅₀为1610 mg L^-1Cl^-，而最耐受家族（E）的LC₅₀高达4570 mg L^-1Cl^-。

3.2. 形态计量学

在受精后<1小时暴露于盐脉冲的胚胎，在暴露结束时其直径随盐浓度增加而显著减小，尤其在4800 mg L^-1Cl^-组最为明显，这可能是高渗环境导致卵周隙水分流失所致。在孵化时，先前暴露于≥1800 mg L^-1Cl^-盐脉冲的仔鱼，其体长显著短于对照组，并且卵黄囊体积更大，表明早期盐暴露干扰了营养吸收和胚胎发育。尽管存在这些早期差异，但到上浮期时，各处理组仔鱼的体长不再有显著差异，显示出一定的发育补偿能力。然而，在≥1800 mg L^-1Cl^-处理组中，仔鱼畸形率（如脊柱弯曲）显著增加至4.5-5.6%，而对照组未发现畸形。此外，暴露于4800 mg L^-1Cl^-的胚胎，其达到50%孵化率的时间比对照组延迟了约6天。

3.3. 离子浓度

盐脉冲暴露立即引起了胚胎离子浓度的紊乱。在受精后<1小时暴露结束即刻，全胚胎（包括卵膜、卵周液和胚胎组织）的钠离子（Na⁺）浓度随暴露浓度增加而显著升高，但在高浓度组出现平台效应；钙离子（Ca²⁺）浓度则呈现下降趋势。这表明早期胚胎尚不具备完善的离子调节能力，盐脉冲可能抑制了其对发育至关重要的Ca²⁺的摄取。在仔鱼孵化时（暴露后约60天），尽管一直饲养在淡水中，先前暴露于盐脉冲的仔鱼仍表现出离子浓度的持续紊乱，例如在2400 mg L^-1Cl^-组，仔鱼全体的Ca²⁺浓度显著高于对照组，这可能是一种对早期缺钙的补偿性反应或自然选择的结果。对于在50%孵化期暴露的仔鱼，盐脉冲结束时其全体Ca²⁺浓度也随盐度增加而升高，但在返回淡水24小时后，这种差异消失。

3.4. 基因表达与应激反应

令人意外的是，无论是在受精后<1小时暴露还是在50%孵化期暴露，在孵化时检测的八个与离子调节、发育、代谢和甲基化相关的靶基因（如NKA^α1b, CFTR等）的mRNA表达量，与对照组相比均未发现显著差异。这可能是由于在全体水平进行检测，分辨率不足以捕捉组织特异性（如鳃组织）的变化。然而，对在50%孵化期暴露的仔鱼进行检测发现，盐脉冲引发了急性应激反应。暴露于1800和4800 mg L^-1Cl^-的仔鱼，其皮质醇浓度显著高于对照组。皮质醇在鱼类应对盐度胁迫和促进离子调节中扮演重要角色。

本研究得出结论，银鲑在受精后极早期（<1小时）存在一个对道路盐污染高度敏感的窗口期。环境相关浓度的24小时盐脉冲暴露可导致延迟性死亡、孵化延迟、生长受阻、畸形率增加以及持续性的离子调节紊乱。这些负面影响存在显著的家族间差异。而在孵化期暴露，仔鱼虽能通过应激反应（如皮质醇升高）和可能的钙离子调节机制更好地耐受盐胁迫，且未观察到长期存活影响。研究强调，当前省级急性氯离子水质指南（600 mg L^-1）虽能提供一定保护，但环境中频繁发生的超标盐脉冲（最高可达指南值11倍）对敏感银鲑家族及种群构成了切实威胁。因此，亟需改进道路融冰实践，减少盐分向鲑鱼产卵溪流的输入，这对于保护日益衰退的太平洋鲑鱼资源具有重要的生态和保育意义。