长链非编码RNA（LncRNA）KCNQ1OT1通过miR-142-3p/TRIM24轴调节视网膜新生血管形成过程中的M2型巨噬细胞极化及血管生成信号通路

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：LncRNA KCNQ1OT1 modulates M2 macrophage polarization and angiogenic signaling via the miR-142-3p/TRIM24 axis in retinal neovascularization

早产儿视网膜病变（ROP）病理机制涉及缺氧诱导的VEGF过度表达，抗VEGF治疗存在复发和副作用问题。本研究揭示lncRNA-KCNQ1OT1通过海绵miR-142-3p解除对TRIM24的抑制，调控STAT6介导的M2巨噬细胞极化及VEGF-A表达，为靶向上游调控网络提供新策略。

　　

余春红|熊伟伟|张月芝|卢洪伟|徐丽文|欧阳志静

江西省南昌大学第二附属医院眼科，330006，中国

摘要

背景

早产儿视网膜病变（ROP）是儿童失明的主要原因，其发病机制与缺氧诱导的VEGF过度分泌有关。抗VEGF疗法存在局限性，包括复发风险和潜在副作用，这凸显了上游调控途径干预的必要性。M2型巨噬细胞在ROP的发病过程中起作用，但控制其极化的调控机制尚不明确。

方法

我们研究了lncRNA KCNQ1OT1、miR-142-3p和TRIM24在RAW264.7和THP-1巨噬细胞、人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）以及氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中的相互作用。通过双荧光素酶报告基因、RNA免疫沉淀和RNA pull-down实验验证了这些相互作用。利用流式细胞术、免疫荧光以及增殖、迁移和管状形成实验评估了这些因子对巨噬细胞极化和内皮功能的影响。OIR小鼠接受了AAV介导的KCNQ1OT1基因传递，随后进行了视网膜组织学检查、免疫染色、细胞因子检测、TUNEL实验、RT-qPCR和Western blot分析。

结果

KCNQ1OT1作为一种竞争性内源性RNA，能够结合miR-142-3p，部分缓解其对TRIM24的抑制作用，并减弱STAT6介导的M2型巨噬细胞极化。在巨噬细胞中，KCNQ1OT1过表达可降低M2型巨噬细胞标志物和VEGFA的表达，从而减轻其对HRMECs的促血管生成效应。在OIR小鼠中，AAV-KCNQ1OT1传递可减少视网膜新生血管形成、M2型巨噬细胞浸润以及VEGFA和炎症细胞因子的水平。

结论

KCNQ1OT1/miR-142-3p/TRIM24轴调控着ROP中的巨噬细胞极化和血管生成信号通路。尽管这些发现仍处于初步阶段，但提示针对这一上游调控网络可能有助于补充现有的抗VEGF疗法。

引言

早产儿视网膜病变（ROP）是全球儿童失明的主要原因之一，其特征是早产儿视网膜的血管发育异常[1]。在病情进展的情况下，由于血管形成延迟导致视网膜缺氧，无血管区域会过度分泌血管内皮生长因子（VEGF），从而引发视网膜新生血管形成（RNV）[2]。虽然玻璃体内抗VEGF疗法能有效抑制病理性血管生成，但其高昂的成本、潜在并发症（如视网膜纤维化）以及高达35%的复发率限制了其应用[3][4]。这些局限性表明，单纯阻断VEGF可能不够充分，因此需要针对调控VEGF表达的上游途径进行干预。

越来越多的研究表明，新生血管组织中的活化巨噬细胞是病理性血管生成的关键驱动因素[5]。这些高度可塑的免疫细胞会分化为不同的表型——经典活化型（M1）和替代活化型（M2）巨噬细胞，其中M2型巨噬细胞在促进视网膜和脉络膜新生血管形成中起着关键作用[6][7]。将巨噬细胞极化从M2型转变为M1型的治疗策略已被证明可以减少血管渗漏和异常增殖[8]。氧诱导视网膜病变（OIR）模型中也观察到M2型巨噬细胞的显著浸润以及VEGFA在mRNA和蛋白质水平的升高[9]。最新研究证实，含有三部分结构基序的24蛋白（TRIM24）是这一过程中的关键调控因子——它作为一种CBP相关E3泛素连接酶，通过促进STAT6的乙酰化来调控巨噬细胞极化。具体而言，TRIM24在Lys119位点对CBP进行泛素化，使CBP能够与STAT6结合，从而抑制M2型巨噬细胞的极化。TRIM24的缺失会破坏这一机制，导致STAT6乙酰化增强、M2型巨噬细胞极化加剧以及VEGFA生成增加[10]。因此，TRIM24在巨噬细胞极化和病理性血管生成过程中起着核心调控作用，为ROP的治疗提供了新的靶点。

基于TRIM24在巨噬细胞极化中的关键作用，我们通过生物信息学筛查（StarBase）发现miR-142-3p是TRIM24的直接上游调控因子，Gly-LDL诱导的内皮细胞实验表明miR-142-3p过表达会加剧血管生成和氧化应激[11]。进一步研究发现lncRNA KCNQ1OT1是这一调控轴的高级调节因子，StarBase预测miR-142-3p在其上具有多个结合位点。在创伤性脑损伤（TBI）模型中的体内实验表明，特异性删除lncRNA-KCNQ1OT1会促使小胶质细胞向M2型极化，同时抑制M1型巨噬细胞的活化[12]，这与miR-142-3p的竞争性内源性RNA（ceRNA）作用一致。综上所述，lncRNA-KCNQ1OT1/miR-142-3p/TRIM24调控轴调控着巨噬细胞的极化过程。

基于这些证据，我们提出了一个新的ROP发病机制调控模型：KCNQ1OT1功能受损会导致miR-142-3p积累，进而抑制TRIM24，激活STAT6依赖的M2型巨噬细胞极化和VEGFA驱动的血管生成。该模型整合了表观遗传（lncRNA）、转录后（miRNA）和翻译后（E3连接酶）调控机制，提供了一种多靶点策略，旨在解决传统抗VEGF疗法无法解决的根源性问题。

细胞培养

人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs；ACBRI-181）购自Cell Systems（美国华盛顿州柯克兰），THP-1单核细胞（TIB-202）和RAW264.7巨噬细胞（TIB-71）来自美国马里兰州的美国典型培养物保藏中心（ATCC）。THP-1细胞系源自急性单核细胞白血病，可在PMA（100 ng/ml）刺激下分化为巨噬细胞样细胞（M0）。HRMECs、THP-1和HEK293T细胞培养于添加10% FBS的RPMI 1640培养基中。

KCNQ1OT1介导的miR-142-3p对TRIM24调控作用的验证

生物信息学分析显示miR-142-3p与TRIM24的3′-UTR之间存在保守的结合位点（图1A）。通过RT-qPCR确认miR-142-3p mimic的有效转染后（图1B），双荧光素酶报告基因实验表明miR-142-3p显著降低了野生型TRIM24的报告基因活性，而预测结合位点的突变则消除了这种效应（图1C）。这些结果一致表明...

讨论

视网膜新生血管形成是一种复杂的病理过程，由缺氧引起的炎症、巨噬细胞极化和异常的血管生成信号通路驱动。尽管抗VEGF疗法可以暂时抑制病理性新生血管形成，但关于复发、长期疗效和潜在的神经发育风险的问题凸显了替代性或上游调控策略的必要性[14][15][16]。本研究发现KCNQ1OT1可能...

结论

总之，我们的研究表明KCNQ1OT1/miR-142-3p/TRIM24轴调控着视网膜巨噬细胞的极化和血管生成（图8）。针对这一ceRNA网络可能有助于重新编程巨噬细胞，规范VEGFA的表达，并减轻ROP中的病理性新生血管形成。这些结果为探索免疫-表观遗传干预措施提供了临床前依据，这些措施可以补充现有的抗VEGF疗法，同时指出需要进一步的研究来...

作者贡献声明

张月芝：数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、数据分析。卢洪伟：验证、方法学设计、实验研究、数据分析。徐丽文：验证、软件使用、实验研究、数据分析。欧阳志静：初稿撰写、数据可视化、软件使用、实验研究、数据分析。余春红：初稿撰写与编辑、研究监督、资金获取、概念构思。熊伟伟：验证

临床试验编号

不适用。

伦理审批和参与同意

所有实验程序均符合ARVO关于眼科和视觉研究中动物使用的准则，并获得了南昌大学第二附属医院动物护理和使用委员会的批准（批准编号NU-7A8D，江西，中国）。

数据获取

本研究的数据可向通讯作者索取。

出版同意

不适用。

利益冲突

作者声明与本研究、作者身份及文章发表无关的潜在利益冲突。

资助

本研究得到了江西省自然科学基金（项目编号S2023ZRMSL1287）的资助。