COVID-19宿主RNA修饰图谱揭示m5C、m6A和假尿苷在病毒发病机制中的关键作用

《Microbiology Spectrum》：Epitranscriptomic signatures of m5C, m6A, and pseudouridine in COVID-19 reveal host RNA modifications involved in viral pathogenesis

本研究首次利用纳米孔直接RNA测序技术，绘制了COVID-19患者全血转录组中5-甲基胞嘧啶(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)和假尿苷(psU)的动态修饰图谱。研究揭示了这些表观转录组标记在免疫应答、病毒防御和炎症通路中的特异性富集，为阐明宿主-病毒相互作用提供了新视角，并提示其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。

　　

RNA修饰作为转录后基因调控的关键层面，通过调控RNA的剪接、稳定性、翻译和免疫信号，在多种生物学过程中发挥核心作用。然而，其在病毒感染过程中的具体角色仍未得到充分探索。本研究应用牛津纳米孔技术公司的直接RNA测序方法，对来自COVID-19患者和健康对照者的全血样本中的三种关键RNA修饰——5-甲基胞嘧啶(m⁵C)、N6-甲基腺苷(m⁶A)和假尿苷(psU)进行了全面分析。

样本与方法

研究纳入了15名受试者，包括9名健康捐赠者和6名经RT-PCR确诊的COVID-19患者。所有患者均住院治疗，并排除了患有肿瘤、自身免疫性疾病或免疫缺陷等情况的个体。采集的全血样本使用Tempus Blood RNA管保存，并通过Tempus Spin RNA Isolation Kit提取总RNA。随后，利用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module进行mRNA富集，并使用SQK-RNA002试剂盒构建直接RNA测序文库，在MinION MK1C测序仪上完成测序。原始信号经Guppy v.6.0.0进行碱基识别。对于m⁵C和m⁶A位点的检测，使用CHEUI工具分析FAST5文件，识别差异修饰位点。对于假尿苷位点的检测，则使用NanoSPA工具对FASTQ文件进行分析。所有分析均排除了血红蛋白编码基因。功能注释通过g:profiler进行Gene Ontology (GO)和KEGG通路富集分析。

假尿苷(psU)修饰在COVID-19中的影响

分析结果显示，假尿苷是RNA中最常见的转录后修饰。在COVID-19患者中鉴定出1,201个具有统计学意义的psU修饰位点，而对照组中为657个位点，其中178个位点为两组所共有。这些修饰对应于COVID-19患者中的1,028个转录本和782个基因，而在对照组中则为588个转录本和467个基因。在转录本区域分布上，psU修饰主要富集于3‘-非翻译区(3’-UTR)，在COVID-19组和对照组中分别有707个和390个位点。在编码序列(CDS)中，psU最常出现在UUU密码子中。此外，psU在不同外显子中的分布也呈现特定模式：第一个外显子中的psU位点多集中于中部，而最后一个外显子中的位点则更靠近外显子起始端。序列 motif 分析发现，psU两侧的保守五核苷酸序列为CUUUC，其中假尿苷恒定地位于第三位。GO富集分析表明，在COVID-19组中，含有psU修饰的基因显著富集于免疫应答、对病毒的反应和防御反应等生物学过程，而在对照组中，对病毒的反应这一术语并未出现，提示psU修饰在病毒感染的特异性宿主应答中扮演重要角色。

5-甲基胞嘧啶(m⁵C)甲基化的比较分析

通过CHEUI程序比较对照组和COVID-19组的m⁵C甲基化位点，共鉴定出689个具有统计学意义的位点，分布于398个转录本和161个独特基因中。其中，366个位点的化学计量差(stoichiometry_diff)大于0.1，表明在COVID-19中甲基化水平升高。这些位点主要位于3‘-UTR和CDS区域。密码子水平分析显示，m⁵C最常出现在GCU、CUG和GAC密码子中。在外显子内的分布上，第一个外显子中的m⁵C倾向于出现在外显子起始端，而最后一个外显子中的m⁵C则富集于外显子末端。 motif 分析揭示了m⁵C位点周围偏好腺嘌呤和鸟嘌呤的序列环境。功能分析显示，这些修饰基因与细胞死亡、应激反应和先天免疫应答等关键通路密切相关。

N6-甲基腺苷(m⁶A)甲基化的比较分析

研究共检测到169,359个m⁶A位点，其中738个在两组间存在显著差异，对应414个转录本和157个基因。与m⁵C类似，大多数显著的m⁶A修饰位于3’-UTR区域。密码子分析表明，m⁶A在AAG、CCA和CAG等密码子中富集。在不同外显子中，m⁶A的分布也呈现位置特异性。序列 motif 分析确认了m⁶A经典的DRACH motif特征。GO分析再次强调了m⁶A修饰在防御反应、应激反应、细胞死亡和先天免疫应答等过程中的核心作用。

修饰基因的分析与KEGG通路关联

综合分析发现，三种RNA修饰共同出现在1,194个基因上。其中，有14个基因同时含有所有三种修饰，包括CAPZB、CSF3R、PIK3CD等，提示这些基因可能受到多层次的转录后调控。KEGG通路富集分析揭示了这些修饰基因显著富集于三条关键通路：“内吞作用”、“FcγR介导的吞噬作用”和“吞噬体”。这些通路与SARS-CoV-2的细胞进入、免疫激活和炎症反应直接相关，突出了RNA修饰在病毒致病机制中的系统级功能。

SARS-CoV-2感染对5-甲基胞嘧啶(m⁵C)动态的影响

m⁵C修饰主要由NSUN家族酶催化，在RNA代谢中发挥多种功能。研究表明，病毒感染可显著影响m⁵C修饰模式。本研究发现，在SARS-CoV-2感染背景下，m⁵C修饰富集于T细胞受体信号通路和α-β T细胞激活等过程。特别值得注意的是，炎症相关基因CSF3R、病毒翻译关键因子CSDE1以及干扰素刺激基因KCNAB2是m⁵C修饰最丰富的基因，表明m⁵C修饰在调节抗病毒免疫和病毒复制中具有重要作用。

SARS-CoV-2感染应答中N6-甲基腺苷(m⁶A) RNA修饰景观的改变

m⁶A是真核生物mRNA中最丰富的内部修饰，参与调控RNA的剪接、翻译、稳定性和亚细胞定位。本研究发现多个关键基因携带m⁶A修饰，其中CDC42、PIK3CD、ATP6V0B、SEC22B和CAPZB尤其值得关注。例如，CDC42与SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞衰老有关；PIK3CD缺陷与免疫缺陷和严重感染易感性相关；而CAPZB已被认为是COVID-19发病过程中的潜在治疗靶点。这些发现强调了m⁶A修饰在协调宿主对SARS-CoV-2感染应答中的复杂网络。

SARS-CoV-2感染中的假尿苷化动态：对免疫调节和RNA疫苗效力的启示

假尿苷化是含量最丰富的RNA转录后修饰之一。本研究发现SARS-CoV-2感染患者中假尿苷修饰位点显著增加，且这些修饰基因同样富集于免疫相关通路。假尿苷化可通过降低未修饰mRNA更常触发的RNA依赖性蛋白激酶的激活，来增强翻译速率。这一机制与在COVID-19 mRNA疫苗中掺入N1-甲基-假尿苷(m1psU)以降低先天免疫原性、增强稳定性和翻译能力的策略不谋而合。这表明SARS-CoV-2可能利用宿主RNA假尿苷化机制作为逃避免疫检测的策略。

RNA病毒间表观转录组特征的比较分析

将本研究结果与其他RNA病毒的研究进行比较发现，m⁶A改变在多种病毒感染中普遍存在，例如HIV-1感染会重塑宿主和病毒的m⁶A景观。同样，H1N1甲型流感病毒感染也报道了全转录组范围的m⁵C重排。假尿苷化动态也被证明伴随病毒感染并影响宿主-病原体相互作用。这些比较数据表明，本研究报道的表观转录组变化并非SARS-CoV-2所独有，而是反映了不同RNA病毒间保守的宿主应答和病毒策略，增强了通路水平结论的普适性。

SARS-CoV-2中RNA 5-甲基胞嘧啶(m⁵C)、N6-甲基腺苷(m⁶A)和假尿苷(psU)修饰及其KEGG通路关联的图谱绘制

本研究揭示了修饰基因与基本细胞过程的关键关联。KEGG通路分析识别出最显著的富集通路是“内吞作用”、“FcγR介导的吞噬作用”和“吞噬体”。SARS-CoV-2利用宿主内吞途径进入细胞，其刺突糖蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用被内化。与此同时，宿主免疫系统通过FcγR介导的吞噬作用参与应答。被免疫球蛋白G(IgG)调理的病毒颗粒与FcγR结合后，被单核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞摄取。随后，吞噬体形成并与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，降解病毒成分并促进抗原呈递。SARS-CoV-2可以感染单核吞噬细胞，导致炎症小体激活和细胞焦亡，释放白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子，这些是重症COVID-19中过度炎症反应的核心介质。“内吞作用”、“FcγR介导的吞噬作用”和“吞噬体成熟”这三条通路的功能汇聚，构成了SARS-CoV-2介导细胞进入、规避先天免疫防御和加剧失调炎症反应的连贯机制轴。针对这些通路的调控为COVID-19的宿主导向疗法提供了合理的治疗策略。

结论

综上所述，本研究对SARS-CoV-2感染期间的RNA修饰进行了全面分析，揭示了表观转录组调控在病毒致病机制和宿主应答中的多层面作用。研究观察到的这些修饰的位置和序列特异性分布表明，感染引发了受到精确控制的表观转录组应答。特别是，m⁵C修饰作为一种宿主限制因子，通过 destabilizing 病毒RNA和调控关键免疫相关基因来影响病毒复制和免疫激活。同样，m⁶A甲基化的动态变化影响关键的信号通路和免疫功能，凸显了感染期间RNA修饰网络的复杂性。此外，假尿苷化的改变有助于翻译控制和免疫调节，对病毒免疫逃逸和mRNA疫苗效力具有重要意义。KEGG通路富集分析为理解SARS-CoV-2致病机制背后的分子相互作用提供了系统级视角。这些发现共同强调了RNA修饰作为潜在治疗干预靶点的重要性。

研究局限性

需要指出的是，本研究中RNA修饰位点的识别基于CHEUI和NanoSPA的计算预测。尽管这两种方法都经过基准测试并显示出较高的预测准确性，但本文报告的结果仍然是推断性的。因此，所报告的修饰基因和位点列表应被视为需要进一步生化验证的推定高置信度候选位点。未来的实验方法，如m⁶A或m⁵C特异性免疫沉淀、亚硫酸氢盐转化或假尿苷谱分析，对于确认这些预测并阐明其在SARS-CoV-2感染中的功能相关性至关重要。本研究使用人类临床材料进行，限制了进行直接实验验证的可行性。然而，通过将计算检测工具与生物通路分析相结合，本研究提供了一个与SARS-CoV-2感染相关的RNA修饰的高置信度图谱，为未来在模型系统中评估已识别的表观转录组变化的功能意义奠定了基础。