STANDARD M10 Flu/RSV/SARS-CoV-2 Fast检测试剂盒在鼻咽拭子中检测甲/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及SARS-CoV-2的性能评估

《Microbiology Spectrum》：Evaluation of the STANDARD M10 Flu/RSV/SARS-CoV-2 Fast assay for the detection of influenza A/B viruses, respiratory syncytial virus, and SARS-CoV-2 in nasopharyngeal swab specimens

本研究评估了新近CE认证的STANDARD M10 Flu/RSV/SARS-CoV-2 Fast检测试剂盒（M10 Fast）的性能。该试剂盒通过增加额外基因靶点提升了灵敏度与覆盖率，并将检测时间从60分钟缩短至36分钟。研究显示，M10 Fast对甲型流感（98.2%）、乙型流感（100%）、RSV（95.1%）和SARS-CoV-2（100%）均表现出高灵敏度与特异性（>99%），其检测限（LOD）低于广泛使用的Allplex试剂盒（RSV除外）。该试剂盒的高性能与快速周转时间有助于临床及时决策与公共卫生响应。

　　

引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）与甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）等其他呼吸道病毒的共循环，给医疗保健提供者和临床微生物实验室带来了重大挑战。由于这些病毒引起的症状和体征相似，临床鉴别诊断非常困难。更复杂的是，共感染也可能发生，尽管其临床意义尚不完全明确。因此，迫切需要能够同时检测和区分多种呼吸道病毒的检测方法。

传统上，基于中心实验室的多重分子检测被认为是同时检测和区分多种呼吸道病毒的金标准。然而，适用于即时检测（POC）的全自动多重分子检测方法，例如Xpert Xpress SARS-CoV-2/Flu/RSV（Xpert）和BIOFIRE Respiratory Panel 2.1 plus（RP2.1plus），因其快速的周转时间和稳健的性能，近年来已成为有吸引力的替代方案。STANDARD M10 Flu/RSV/SARS-CoV-2 Fast检测试剂盒（M10 Fast）于2025年8月获得CE认证，是一款适用于POC使用的全自动多重分子检测试剂盒，也是STANDARD M10 Flu/RSV/SARS-CoV-2检测试剂盒（M10）的更新版本。总体而言，先前的M10试剂盒表现出与广泛使用的分子检测方法（如Xpert）相当的性能，但在检测低病毒载量方面能力有限。M10 Fast试剂盒通过纳入额外的基因靶点来提高灵敏度和覆盖率，同时将运行时间从60分钟减少到36分钟；然而，其性能数据仍然有限。

本研究旨在评估M10 Fast试剂盒的分析和临床性能，并将其与广泛使用的基于中心实验室的分子检测方法——Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV检测试剂盒（Allplex）进行比较。

材料与方法

临床标本

本研究共纳入664份病毒转运培养基（VTM）中的鼻咽拭子标本。其中545份标本是在2023年2月至2025年2月期间于韩国首尔三星医疗中心作为常规患者护理的一部分收集的（包括108份甲型流感阳性、79份RSV阳性、165份SARS-CoV-2阳性、2份甲型流感/RSV共阳性、1份RSV/SARS-CoV-2共阳性以及190份阴性标本），另外119份乙型流感阳性标本购自瑞士的Trina Bioreactives AG。所有标本均经RP2.1plus确认，并储存于-70°C直至使用。使用前在室温下解冻，由两名不了解标本身份和先前检测结果的技术人员使用M10 Fast和Allplex试剂盒进行同步检测。

分子检测方法

RP2.1plus是一种全自动多重分子检测方法，能够在45分钟内同时检测23种呼吸道病原体，包括SARS-CoV-2、甲型/乙型流感和RSV。操作按照制造商说明进行：将300 μL标本与样本缓冲液混合后加入测试袋，并将其插入BioFire FilmArray 2.0仪器中，仪器自动完成核酸提取、扩增和结果分析。

M10 Fast试剂盒的检测靶标包括SARS-CoV-2的ORF1ab、E和N基因；甲型流感的M和PB2基因；乙型流感的NS1和M基因；以及RSV的M和N基因。操作按照制造商说明进行：将300 μL标本加入测试卡盒，并将其插入STANDARD M10仪器中，仪器自动完成核酸提取、扩增和结果分析。

Allplex试剂盒的检测靶标包括SARS-CoV-2的RdRp、S和N基因；甲型流感的M基因；乙型流感的NS2基因；以及RSV的M基因。操作按照制造商说明进行：使用KingFisher Flex系统提取RNA，将10 μL提取的RNA与10 μL反应主混合液结合，最终体积为20 μL。在CFX96实时PCR检测系统上进行扩增，循环条件包括：50°C 20分钟，95°C 15分钟，随后进行3个循环（95°C 10秒，60°C 40秒，72°C 20秒），接着进行42个循环（95°C 10秒，60°C 15秒，72°C 10秒）。结果使用Seegene Viewer软件自动分析。

对于结果不一致的标本，使用cobas Liat SARS-CoV-2和Influenza A/B检测或cobas Liat Influenza A/B & RSV检测（统称为cobas Liat）进行进一步分析。这些是全自动分子检测方法，可在20分钟内提供结果。操作按照制造商说明进行：将200 μL标本加入检测管，并将其插入cobas Liat分析仪中，仪器自动完成核酸提取、扩增和结果分析。

分析性能评估

使用AMPLIRUN TOTAL SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV CONTROL RNA标准品评估M10 Fast试剂盒的检测限（LOD）和重复性。将该RNA标准品在阴性鼻咽拭子标本池中进行系列稀释，每个稀释水平测试20个重复。通过检测28种非靶向呼吸道病原体（每种病原体在临床相关浓度下重复测试两次）来评估M10 Fast试剂盒的交叉反应性。具体而言，细菌和酵母菌的测试浓度≥1 × 10⁶CFU/mL或拷贝数/mL，病毒的测试浓度≥1 × 10⁵拷贝数/mL。

数据分析

以RP2.1plus作为参考标准，计算M10 Fast和Allplex试剂盒的灵敏度和特异性。计算两种试剂盒之间的阳性符合率（PPA）、阴性符合率（NPA）和Cohen's kappa值。使用Pearson相关系数（r）比较两种试剂盒均呈阳性的标本的Ct值。通过概率回归分析确定LOD。通过计算Ct值的变异系数（CV）评估重复性。所有统计分析均使用Excel和MedCalc Statistical Software version 23.0.6进行。

结果

临床性能

以RP2.1plus作为参考标准，M10 Fast试剂盒对甲型流感、乙型流感、RSV和SARS-CoV-2的灵敏度分别为98.2%、100%、95.1%和100%，而Allplex试剂盒对相同靶标的灵敏度分别为88.2%、100%、91.5%和100%。两种试剂盒对所有病毒均表现出高特异性（>99%）。两种试剂盒之间的一致性很高，PPA范围在98.0%至100%之间，NPA范围在97.9%至100%之间。Cohen's kappa值范围在0.92至1.00之间，表明几乎完全一致。在RP2.1plus确认的三份共感染标本中，M10 Fast试剂盒在所有标本中均检测到了相应的所有靶标，而Allplex试剂盒在一份甲型流感/RSV共阳性标本中漏检了甲型流感。所有病毒靶标的Ct值均显示出强烈的线性关系，Pearson相关系数（r）范围在0.892至0.981之间。

不一致结果分析

共有31份标本在RP2.1plus与M10 Fast或Allplex试剂盒之间的检测结果不一致。所有这些标本对应靶标的Ct值均较高（>30）。最常见的不一致涉及甲型流感（n= 18）。其中13份经RP2.1plus确认为甲型流感阳性，但仅在Allplex试剂盒中呈阴性（n= 11）或在M10 Fast和Allplex试剂盒中均呈阴性（n= 2）。使用cobas Liat进一步分析显示，这13份标本中有11份为甲型流感阳性，而2份为阴性。其余5份经RP2.1plus确认为甲型流感阴性，但仅在M10 Fast试剂盒中呈阳性（n= 1）、仅在Allplex试剂盒中呈阳性（n= 2）或在两种试剂盒中均呈阳性（n= 2）；其中只有后两份标本经cobas Liat确认为甲型流感阳性。

第二常见的不一致涉及RSV（n= 9）。其中8份经RP2.1plus确认为RSV阳性，但仅在M10 Fast试剂盒中呈阴性（n= 1）、仅在Allplex试剂盒中呈阴性（n= 4）或在两种试剂盒中均呈阴性（n= 3）。使用cobas Liat进一步分析显示，这8份标本中有7份为RSV阳性，而1份为阴性。剩余的一份标本经RP2.1plus确认为RSV阴性，但仅在M10 Fast试剂盒中呈阳性，经cobas Liat确认为RSV阳性。

其余的不一致涉及SARS-CoV-2（n= 4），所有这些标本经RP2.1plus确认为SARS-CoV-2阴性，但仅在M10 Fast试剂盒中呈阳性；经cobas Liat检测，其中3份为SARS-CoV-2阴性，1份为阳性。

分析性能

M10 Fast试剂盒对甲型流感、乙型流感、RSV以及SARS-CoV-2的ORF1ab/E基因和N基因的LOD分别为7.8、35.3、532.7、34.7和88.0 拷贝数/mL。该试剂盒表现出高的运行间重复性，在浓度高于2倍LOD时，Ct值的CV≤3.5%。在分析特异性评估中，未观察到与任何测试的呼吸道病原体发生交叉反应。

讨论

本研究评估了M10试剂盒的更新版本——M10 Fast试剂盒的分析和临床性能，并将其与广泛使用的商业分子检测方法Allplex试剂盒进行了比较。以RP2.1plus作为参考标准，M10 Fast试剂盒对所有病毒靶标均表现出高灵敏度（>95%）和高特异性（>99%），与Allplex试剂盒的性能相当。M10 Fast试剂盒具有高分析灵敏度，其LOD低于100拷贝数/mL（RSV除外），并且与Allplex试剂盒相比，具有优异或相当的临床灵敏度。

与先前M10试剂盒相比，M10 Fast试剂盒的一个关键特点是针对每种病毒增加了一个额外的基因靶点（甲型流感增加PB2，乙型流感增加M，RSV增加N，SARS-CoV-2增加E），以提高灵敏度和覆盖率。正如预期，其分析灵敏度非常出色，对甲型流感、乙型流感、RSV以及SARS-CoV-2的ORF1ab/E基因和N基因的LOD分别为7.8、35.3、532.7、34.7和88.0 拷贝数/mL——显著低于先前报道的M10试剂盒的LOD。这些值也远低于Allplex试剂盒的LOD（RSV除外），并且与已知比M10试剂盒灵敏度更高的Xpert plus试剂盒的LOD相当。这种增强的灵敏度使得M10 Fast试剂盒能够比Allplex试剂盒检测到更多经RP2.1plus确认的甲型流感阳性和RSV阳性标本。尽管M10 Fast试剂盒未能检测出两份甲型流感阳性和四份RSV阳性标本，但除一份外，其余标本Allplex试剂盒也未能检出。使用cobas Liat进一步分析表明，这些标本要么未被检测到，要么检测到的Ct值>30，表明病毒载量较低。值得注意的是，M10 Fast试剂盒在八份经RP2.1plus检测对应靶标为阴性的标本中检测到了甲型流感（n= 3）、RSV（n= 1）或SARS-CoV-2（n= 4）。虽然这些标本的结果在本研究中被归类为假阳性，但其中一些也被Allplex试剂盒或cobas Liat检测到，这可能反映了M10 Fast试剂盒的高灵敏度。重要的是，M10 Fast试剂盒针对每种病毒包含两到三个基因靶点，而Allplex和cobas Liat试剂盒（除SARS-CoV-2外）对每种病毒仅使用单一靶点。这种多靶点设计最大限度地减少了病毒基因突变对检测灵敏度的影响。需要使用更灵敏的分子方法进行进一步确认，以确定这些结果是真阳性还是假阳性。

M10 Fast试剂盒在本研究中表现出良好的整体性能；然而，其未能检测出两份经RP2.1plus确认的甲型流感阳性标本和四份RSV阳性标本引起了关注。对RSV的相对较低灵敏度可能归因于该靶标的高LOD。因为一些具有临床意义RSV感染的患者，其鼻咽拭子标本中的病毒载量可能低至10²–10³拷贝数/mL，无法可靠检测该范围内的病毒载量是一个显著的局限性。虽然制造商未披露高LOD的确切原因，但检测设计因素——例如所选靶标区域或引物/探针配置——可能会降低低病毒浓度下的扩增效率。未能检测出病毒阳性标本也可能源于引物/探针区域的序列变异。呼吸道病毒（包括SARS-CoV-2和流感病毒）突变速度足够快，偶尔会影响实时PCR检测的性能；然而，鉴于M10 Fast试剂盒的多靶点设计，因序列变异而漏检病毒阳性标本的可能性不大。Xpert plus试剂盒采用了类似的多靶点设计，对这两种试剂盒的比较评估将是未来研究的重点。

全自动、基于卡盒的检测方法，如M10 Fast、Xpert、RP2.1plus和cobas Liat，具有若干优势。它们将样本制备、核酸提取、扩增和检测整合到一个工作流程中，减少了周转时间，最小化了人工操作，并降低了人为错误的风险。所有反应都在封闭的卡盒内进行，进一步降低了交叉污染的风险。用于这些检测的仪器体积紧凑，可以在中心实验室之外（如门诊或急诊室）运行，使其适用于POC使用。尽管有这些好处，但这些检测通常比基于中心实验室的分子检测（如Allplex试剂盒）更昂贵，这可能会限制其在资源有限环境中的使用。在疫情期间，由于通量有限，它们可能也不太适合满足高检测需求。尽管可以通过安装额外模块来扩大通量，但这涉及相当大的成本。检测成本仍然是全自动、基于卡盒的检测方法在资源有限环境中广泛采用的主要障碍；然而，其快速的周转时间可以缩短住院时间并减少不必要的抗生素使用，由此产生的成本节约可能抵消较高的检测成本。临床微生物实验室在选择分子检测方法时，不仅应基于检测需求和可用资源，还应考虑这种成本节约的潜力。

本研究的一个主要局限性是使用了存档标本。经RP2.1plus确认的病毒阳性标本在储存和冻融过程中可能发生了RNA降解，这可能低估了M10 Fast和Allplex试剂盒的临床灵敏度。然而，由于两种试剂盒是平行测试的，这种影响可能对它们产生了相似的程度。此外，我们的标本仅经历了一次冻融循环，并且在类似环境下进行的先前研究表明，长期储存标本对通过实时PCR检测呼吸道病毒没有显著影响。因此，我们认为RNA降解不太可能是导致M10 Fast和Allplex试剂盒假阴性结果的主要因素。为了更准确地评估检测性能，特别是对于低病毒载量的标本，需要使用新鲜标本进行前瞻性研究。另一个局限性是乙型流感阳性标本来源于外部，样本收集、储存和运输的异质性可能影响了检测性能。然而，观察到的乙型流感的高性能很可能归因于缺乏低病毒载量（Ct值 >37）的标本，需要纳入此类标本进行进一步研究。此外，仅包含三份共感染标本，不足以评估该检测方法检测共感染的能力。最后，单中心设计限制了本研究结果的普适性，凸显了进行多中心评估的必要性。

结论

总之，我们的研究结果表明，更新后的M10 Fast试剂盒能够以高灵敏度和特异性可靠地检测甲型/乙型流感病毒、RSV和SARS-CoV-2，并改善了对低病毒载量的检测能力。其增强的性能和更快的周转时间有助于及时的临床决策和公共卫生响应，特别是在流感、RSV和SARS-CoV-2共循环期间。

致谢

本研究获得了韩国SD Biosensor公司的支持，并获得了由韩国保健产业振兴院（KHIDI）管理的韩国健康技术研发项目（Korea Health Technology R&D Project）的资助（资助号：RS-2024-00332244和RS-2025-02232997）。资助方在研究设计、数据收集、分析、解释以及本文的撰写和发表方面没有任何作用。