《Atherosclerosis》：Isolinderalactone alleviates atherosclerosis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation and inflammatory response in macrophages
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动脉粥样硬化（AS）炎症机制研究显示异林达酯酮（ISO）通过靶向NLRP3蛋白Cys470位点抑制炎症小体活化，降低IL-1β分泌和斑块形成，为AS治疗提供新策略。
邵静静|徐浩文|宁芳敏|徐雷宇|李卫峰|徐勇|王哲|陈海义|史秉璐|孔颖|亚历山大·V·萨莫罗多夫|万干|王毅
中国浙江省抗癌中药与天然药物重点实验室，杭州师范大学药学院，中国浙江省杭州市311121
摘要
背景
动脉粥样硬化性心血管疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，迫切需要发现新的治疗策略。Isolinderalactone（ISO）是一种从Lindera aggregata根中提取的倍半萜化合物，具有显著的抗炎作用。鉴于动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症性疾病，ISO对动脉粥样硬化疾病的疗效和作用机制仍不清楚。
目的
本研究旨在评估ISO作为NLRP3抑制剂在动脉粥样硬化管理中的治疗潜力。
方法
在体内研究中，给ApoE-/-小鼠喂食高脂饮食以诱导动脉粥样硬化模型，以评估ISO的治疗效果。在体外研究中，使用骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）来阐明ISO抑制NLRP3炎性小体激活的具体分子机制。通过质谱分析和分子对接分析来确定活性位点。
结果
我们的数据显示，ISO通过抑制NLRP3炎性小体激活和炎症反应减少了动脉粥样硬化斑块的形成。网络药理学分析表明，ISO可能通过抑制NOD样受体（NLR）通路来缓解动脉粥样硬化，从而减少炎症介质。ISO以剂量依赖的方式通过抑制NLRP3炎性小体激活来抑制IL-1β的分泌，IC50值为2.882 μM。此外，ISO选择性地阻断了ASC寡聚体的形成并破坏了NLRP3炎性小体复合物的组装。质谱分析和对接模拟显示，ISO与NLRP3蛋白形成了共价键，特异性地作用于其NACHT结构域内的Cys470位点。
结论
总体而言，ISO作为一种新的NLRP3抑制剂，显示出治疗动脉粥样硬化疾病的潜力。
引言
动脉粥样硬化（AS）在心血管疾病中起着重要作用，是全球疾病和死亡的主要驱动因素[1]。这种状况涉及主要动脉中的斑块积聚，由内皮损伤、脂质积累、免疫细胞募集、平滑肌细胞生长以及导致斑块形成的渐进性改变引起[2]。炎症，特别是炎症细胞释放的细胞因子，在动脉粥样硬化的进展中起着重要作用[3]。当血管内皮受到刺激时，会引发炎症反应，导致炎症细胞积聚和单核细胞转化为泡沫细胞，从而引发动脉粥样硬化。特别是巨噬细胞在整个复杂的动脉粥样硬化过程中都起着重要作用，从起始阶段到斑块破裂和伤口愈合。这些巨噬细胞在斑块内表现出显著的异质性和可塑性[4]。此外，慢性炎症会促进斑块生长和纤维帽变薄。最终，炎症会导致斑块破裂、凝血系统激活和血栓形成，从而引发急性心血管事件[5]。因此，抑制巨噬细胞中的炎症可能成为治疗动脉粥样硬化疾病的关键方法。
NLRP3蛋白是一种NOD样受体（NLR）家族成员，具有NACHT、LRR和PYD结构域，作为重要的细胞内免疫传感器[6]。NLRP3炎性小体在调节炎症反应中起着关键作用，对包括感染、代谢紊乱和细胞损伤在内的多种触发因素作出反应[7]。在启动后，NLRP3与ASC适配蛋白和caspase-1结合，构建炎性小体复合物。随后，该复合物介导无活性的pro-IL-1β和pro-IL-18切割并成熟为其生物活性形式，然后被分泌。通过启动这一过程，NLRP3通过免疫细胞的募集和激活来放大炎症。这种机制的失调会导致各种病理状况，如感染、自身免疫性疾病和心血管病理[8]。因此，针对NLRP3炎性小体的激活可能提供一种可行的治疗途径，以阻止动脉粥样硬化的进展。
Isolinderalactone（ISO）是一种从Lindera aggregata根中天然提取的倍半萜化合物，具有多种生物活性，如抗炎、心血管保护和神经保护作用，特别是在治疗炎症性疾病方面。它在医学应用中具有巨大潜力，并在乌头类药物治疗中发挥着重要作用[9]。Shen等人发现，ISO通过抑制NF-κB信号通路来减轻急性肺损伤，NF-κB是炎症的关键调节因子[10]。此外，Lin等人报告称，ISO通过抑制IL-6/STAT3信号通路来减轻奥沙利铂对大鼠的肝脏损伤，显示出其抗炎和保肝特性[11]。另外，ISO还参与神经退行性和肿瘤性疾病，通过JNK通路调节来预防阿尔茨海默病和结直肠癌[12],[13]。然而，ISO对动脉粥样硬化的作用机制及其分子靶点仍不清楚。
本研究揭示了ISO对NLRP3的抑制作用，通过抑制NLRP3炎性小体的激活来减少动脉粥样硬化的进展。ISO的作用机制是通过与NLRP3的NACHT结构域内的Cys470位点共价结合来破坏NLRP3的组装和激活。这些发现突显了ISO作为NLRP3抑制剂在动脉粥样硬化管理中的显著治疗潜力。
试剂
ISO（#PCS1709）购自Herbpurify Biotech Co., Ltd（中国成都）。LPS（#L4391）、三磷酸腺苷（ATP，#A3377）和明矾（#A6435）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。Nigericin（#HY-127019）、Pam3CSK4（#HY-P1180A）和PMA（#HY-18739）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 junction）。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL，#YB-002）购自广州亿源生物技术公司。抗NLRP3（Adipogen，AG-20B-0014）、抗caspase-1（Adipogen，AG20B-0042）
ISO减少高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠的动脉粥样硬化斑块
由于ISO在体外和体内实验中显示出强烈的抗炎作用，它可能在动脉粥样硬化中具有治疗效果。为了研究ISO对动脉粥样硬化的潜在效果，按照图1A中的方案，通过灌胃给予ISO 8周。图1B展示了ISO的结构图。选择ISO的剂量（10 mg/kg）是基于先前的研究，这些研究表明该浓度对其治疗阿尔茨海默病和急性肺损伤有效[10],[12]。
讨论
本研究显示，ISO通过选择性抑制NLRP3炎性小体激活来减少动脉粥样硬化。体外实验表明，ISO以剂量依赖的方式抑制了NLRP3炎性小体激活和NLRP3介导的焦亡。值得注意的是，ISO选择性地针对NLRP3炎性小体，而不影响其他炎性小体，如NLRC4、NLRP1和AIM2，这突显了其作为NLRP3特异性抑制剂的效力。此外，ISO没有影响NLRP3的初始事件
结论
总之，我们的研究表明，ISO通过共价结合NLRP3中的Cys470位点来抑制巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活，从而抑制动脉粥样硬化的进展。这是首次将ISO确定为治疗动脉粥样硬化的潜在药物和共价NLRP3抑制剂。我们的发现表明ISO作为减缓动脉粥样硬化疾病进展的治疗候选物具有潜力，尽管还需要进一步的研究才能应用于临床。
作者贡献
JJS和HWX参与了文献搜索和研究设计。JJS参与了论文的起草。JJS、HWX、FMN、LYX、WFL进行了实验。FMN、LYX、YX协助进行了动物实验。BLS、YK、ZW、HYC、A. V. Samorodov、WG参与了数据收集和分析。YW监督了项目并修订了手稿。所有作者都批准了手稿的最终版本。
数据可用性声明
所有数据均已纳入文章及其补充材料中。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：作者声明没有利益冲突。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号82361138563和82370244，资助人Y.W.）和杭州市创新团队（TD2024002，资助人Y.W.）的支持。
