在粪便发酵过程中，金钗石斛多糖的结构特征及其免疫调节活性的动态变化

《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》：Dynamic Changes in Structural features and Immunomodulatory activities of Dendrobium officinale Polysaccharide during Fecal Fermentation

本研究系统探究了石斛多糖（DOP）在仔猪和成年猪粪便发酵过程中的动态结构特征及其免疫调节活性变化。结果表明，发酵导致DOP分子量显著降低（p<0.05），葡萄糖/曼 noses比值和乙酰化程度下降，而单糖组成和糖苷键类型基本保持稳定。免疫活性随发酵时间延长呈剂量依赖性下降，且成年猪肠道菌群中益生菌（如梭菌属、瘤胃菌属）丰度显著提升（p<0.01）。机制分析表明，DOP通过直接激活NF-κB/TLR4信号通路和间接调控肠道菌群产SCFAs双重途径发挥免疫调节作用，为解析多糖结构-功能关系提供理论依据。

　　

孙振鸥|周玉媛|马轩|王月|康吉|王华莉

中国天津市天津科技大学食品科学与技术学院，国家食品营养与安全重点实验室，300457

摘要

铁皮石斛多糖（DOP）因其显著的免疫调节活性而被广泛研究。然而，DOP在发酵过程中的结构-功能关系尚不清楚。本研究系统地探讨了断奶猪和成年猪肠道发酵过程中DOP的结构特征和免疫调节活性的动态变化。在模拟消化过程中，DOP的结构保持不变。但在发酵过程中，DOP的分子量（Mw）、葡萄糖与甘露糖的比例以及乙酰基含量显著降低。虽然其单糖组成和糖苷键类型未发生变化，但检测到了一些微小的比例和摩尔比例的变化。这种趋势在成年猪的肠道发酵中更为明显，表明DOP被肠道微生物群更有效地降解和利用。此外，DOP的免疫活性随发酵时间的延长而降低，这可能是由于分子量和乙酰基含量的减少。此外，16S rDNA测序分析显示有益细菌（如梭菌属和瘤胃球菌属）的数量明显增加，表明DOP可以调节肠道微生物的组成和丰度。因此，尽管DOP直接激活巨噬细胞极化的能力在发酵过程中减弱，但它可以通过调节肠道微生物群部分弥补这一缺陷。总之，本研究加深了对DOP在发酵过程中免疫调节作用机制的理解，并为其结构-功能关系建立了理论基础。

引言

铁皮石斛（Dendrobium officinale）以其丰富的生物活性成分而闻名，包括多糖、生物碱、维生素和氨基酸，其中多糖被认为是其主要活性成分（He等人，2016年）。具体来说，铁皮石斛多糖（DOP）主要由葡萄糖和甘露糖组成（Man:p : Glc:p = 2.01:1.00 - 8.82:1.00），其特征是在特定位置发生乙酰化，聚合程度不一，以及半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖的摩尔比例和糖苷键类型多样（Chen等人，2021年）。DOP的免疫调节作用已被广泛报道，尽管不同的提取和分离方法会产生不同的免疫反应（Li等人，2021年；He等人，2022年）。提出了两种相关的免疫调节机制：1）激活免疫细胞中的不同信号通路；2）调节肠道微生物的组成（Chen等人，2021年；Li等人，2022年）。例如，研究发现DOP可以促进RAW 264.7细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（NO），这是通过核因子κB（NF-κB）/Toll样受体4（TLR4）信号通路实现的（Huang等人，2018年）。

肠道被认为是微生物群与宿主之间的“桥梁”，因此常被称为人体的“第二大脑”。大多数非淀粉多糖不能直接消化，必须经过发酵才能被微生物群利用（Xu等人，2022年）。同时，可发酵的多糖可以动态调节肠道微生物的数量和组成，从而促进短链脂肪酸（SCFAs）和其他生物活性代谢物的产生（Walker等人，2005年；Hu等人，2012年）。有研究表明，DOP通过调节肠道微生物群和修复LPS/TLR4/TRIF/NF-κB轴来缓解2型糖尿病（Chen, Chen & Fu，2023年）。研究显示，DOP显著增加了体内有益肠道微生物（如拟杆菌属、乳酸杆菌属和毛螺菌科）的相对丰度。同时，它减少了有害细菌（如大肠杆菌-志贺菌）的数量，并增强了SCFAs的产生（Chen等人，2022年；Huang等人，2018年；Xie等人，2022年）。然而，DOP在肠道内的结构特征动态变化及其对这些免疫调节活性的影响仍不完全清楚。

总体而言，本研究的假设如下：DOP通过两种机制发挥其免疫调节作用：首先，直接作用于免疫细胞；其次，通过其在发酵过程中的降解促进有益肠道微生物的增殖。这种双重机制取决于DOP的结构特性及其与肠道微生物群的相互作用。因此，在本研究中，使用断奶猪和成年猪的样本进行了体外肠道发酵实验。在发酵过程中的不同时间点从发酵培养基中回收DOP分子，随后对其分子结构和免疫调节活性进行了表征，并分析了发酵过程中肠道微生物群组成的变化。这些发现旨在为揭示DOP免疫调节作用的结构-功能关系提供科学基础。

材料

DOP是通过实验室中的分离和纯化程序获得的，其理化参数已预先分析（Wang等人，2021年）。

DOP的体外模拟唾液-胃肠道消化

DOP的体外模拟唾液-胃肠道消化是根据先前报道的方法进行的（Wu等人，2021年）。消化后，测定了分子量（Mw）、总多糖含量和还原糖含量。

猪结肠消化物样本的制备

来自5个月大、体重100-120公斤的成年猪的结肠消化物

DOP的体外消化

我们实验室之前的研究表明，DOP的分子量为637.61 ± 86.24 kDa，总糖含量为86.39 ± 2.06%（Shan等人，2023年）。在模拟口腔、胃或小肠消化过程中，DOP的分子量和总糖含量没有明显变化（图1和表S2）。然而，在胃和小肠消化过程中，还原糖含量显著增加，而在口腔消化过程中没有变化

结论

在口腔、胃液和小肠的模拟消化过程中，DOP的结构保持不变。在发酵过程中，DOP的分子量（Mw）、葡萄糖与甘露糖的比例以及乙酰基含量显著降低。虽然DOP的单糖组成和糖苷键类型未发生变化，但观察到它们之间的比例和摩尔比例有轻微变化。此外，本研究初步证实了分子量和乙酰基含量的降低

作者贡献声明

王华莉：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、研究、概念化。 康吉：软件、资源、项目管理、资金获取。 马轩：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件、方法学、研究、资金获取、正式分析。 王月：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证。 孙振鸥：撰写 – 原稿撰写、研究、资金获取、正式分析、数据管理。

未引用的参考文献

Alvarez等人，2021年；Chen等人，2023年；Chen等人，2023年；Fu等人，2021年；Li等人，2022年；Shang等人，2018年；Wu等人，2021年。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32402076）、天津市科技计划（项目编号：21ZYJDJC00110）以及北京联合大学的学术研究项目（项目编号：ZK10202306）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。