将非侵入性遗传学技术与SECR方法相结合，以估算巴基斯坦雪豹的种群数量

《Biological Conservation》：Integrating noninvasive genetics and SECR to estimate snow leopard population in Pakistan

雪豹种群密度为0.17/100平方公里，总数约168（95%CI129-220.6），验证SNP面板与SECR模型结合的监测有效性，建议加强保护区巡护。

　　

Shakeel Ahmad|Katherine A. Solari|Ian Durbach|Hussain Ali|Shoaib Hameed|Jaffar Ud Din|Muhammad Asif|Dmitri A. Petrov|Muhammad Ali Nawaz

环境科学项目，生物与环境科学系，文理学院，多哈，卡塔尔 2713

摘要

了解大型食肉动物（如全球濒危的雪豹Panthera uncia）的数量和密度对其保护以及评估管理措施至关重要。雪豹栖息在南亚和中亚高海拔地区的偏远和恶劣地形中，分布于12个国家。它是巴基斯坦研究最少的哺乳动物之一，其种群数据的可靠性非常有限。本研究采用了一种新的非侵入性遗传学方法——一种专门针对雪豹设计的SNP（单核苷酸多态性）面板，用于个体识别。2017年至2023年间，在雪豹的分布范围内收集了超过一千份疑似雪豹的粪便样本，其中235份经过基因鉴定属于雪豹。共有179份雪豹样本成功完成基因分型，鉴定出56个独特个体，其中63%为雄性。基于空间显式捕捉-重捕（SECR）模型的平均预测显示，巴基斯坦雪豹的密度为每100平方公里潜在栖息地0.17只（95%置信区间0.130–0.225），估计种群数量为167.9只（95%置信区间129.0–220.6只）。研究结果表明，这种新的SNP面板结合SECR方法可以有效监测雪豹种群。这些结果验证了通过相机陷阱获得的种群估计数据，并为监测巴基斯坦雪豹种群建立了可靠的基准。此外，我们建议加强对其主要栖息地的保护，以减少偷猎行为，促进雪豹及其猎物的生存。

引言

在资源有限且人口不断增长的世界中，野生动物的管理和保护变得越来越重要，许多野生动物种群正受到人类活动的压力（Marques等人，2013年）。可靠地估计动物种群数量和密度是制定种群动态模型和实施保护管理计划的关键（Santini等人，2022年；Soisalo和Cavalcanti，2006年；Williams等人，2002年）。尽管可靠地评估动物种群数量是了解其野外状况的重要指标，但由于各种挑战，这可能是一项非常困难的任务（Caughley，1977年；Williams等人，2002年）。许多物种，尤其是大型食肉动物，由于夜间活动而难以观察，且由于它们分布在广阔的地理区域内，检测概率较低，使得大规模的调查难以获得可靠的种群估计数据（Boitani等人，2013年；Carter等人，2019年；Guschanski等人，2009年；Karanth，1995年）。因此，在大多数情况下，种群数量估计数据并不存在，管理者不得不依赖当地的知识和看法，而这往往大大低估或高估了实际数量，特别是对于隐秘物种（Moqanaki等人，2018年）。因此，通过经济可行且可靠的方法评估和监测种群规模是制定基于事实的管理措施的关键（Augustine等人，2020年；Santini等人，2022年）。 技术的进步使得可以使用多种技术可靠地监测动物种群，例如相机陷阱（Nawaz等人，2021年；Rovero和Zimmermann，2016年；Sharma等人，2014年）、非侵入性遗传分析（Barrueto等人，2022年；Chetri等人，2019年；Karmacharya等人，2011年）、遥测（Smith等人，2020年）、生物声学（Obrist等人，2010年）等。在这些方法中，相机陷阱和非侵入性遗传学是最常用的稳健调查方法，用于监测稀有食肉动物种群（Chetri等人，2019年；Karanth和Nichols，1998年；Sharma等人，2014年）。然而，非侵入性遗传监测被认为更为有效（McCarthy等人，2008年），因为它能够提供多种信息——物种识别、个体识别、数量估计、种群分配、饮食组成以及扩散和连通性（Demay等人，2015年；Hohenlohe等人，2021年；Janjua等人，2020年；Nawaz等人，2019年；Singh等人，2022年；Sollmann等人，2013年；Wadley等人，2014年）。 “非侵入性DNA采样”是指在不捕捉、处理或以其他方式干扰动物的情况下获取遗传物质的方法，从而避免对其行为或适应能力造成影响。这涉及收集动物在环境中留下的遗传痕迹，而不会对其造成任何干扰（Lefort等人，2022年）。这些遗传痕迹可以通过类似于法医学领域的现场和分子方法从粪便、尿液或唾液中提取（Pedersen等人，2015年；Taberlet等人，2012年）。粪便DNA是最常见的非侵入性遗传物质来源（Carroll等人，2018年），并已成功用于监测野生动物种群（Bhatt等人，2020年；Chetri等人，2019年；Dures等人，2019年；Jane?ka等人，2008年；Karmacharya等人，2011年；Natesh等人，2017年）。 遗传工具、微卫星和单核苷酸多态性（SNP）常用于遗传标记-重捕研究中，通过非侵入性样本估计种群规模和密度（Anile等人，2014年；Clendenin等人，2020年；von Thaden等人，2020年）。然而，使用微卫星作为遗传标记存在一些缺点，例如从粪便等非侵入性DNA来源扩增微卫星时，由于DNA质量较低，基因分型错误率较高（Janjua等人，2020年；Kraus等人，2015年）。这种基因分型错误可能导致个体识别错误（Waits和Paetkau，2005年），进而导致种群估计不准确（Janjua等人，2020年）。另一方面，SNP在标准化评估受保护物种方面越来越受欢迎（Henriques等人，2018年；Kraus等人，2015年；Li等人，2018年）。与微卫星相比，SNP在基因组中数量更多，从退化或低质量样本中更容易恢复，成本更低，准确性更高，并且在不同实验室之间更容易比较（Fola等人，2020年；Pérez-González等人，2023年）。SNP遍布整个基因组，尽管某些区域的SNP密度较高，而其他区域则较低（Das等人，2012年；Koboldt等人，2006年）。这些SNP可以使用日益普及的下一代测序数据轻松识别（Garvin等人，2010年；Helyar等人，2011年）。SNP基因分型已成功应用于非侵入性样本，并且基因分型错误率较低（Burgess等人，2022年；Hayward等人，2022年；Kraus等人，2015年；Mamugy等人，2024年；Schultz等人，2018年）。 雪豹（Panthera uncia）是一种隐秘的大型猫科动物，分布在南亚和中亚12个国家的山区，覆盖面积约为280万平方公里（Bian等人，2023年；Fox，1994年；Jackson和Hunter，1996年；McCarthy等人，2016年；Snow Leopard Network，2014年）。尽管分布范围广泛，但全球雪豹种群数量却很少（Chetri等人，2019年）。据估计，全球雪豹数量在4000至7996只之间，但这一估计缺乏可靠依据，大多数现有估计都只是猜测（Fox，1994年；McCarthy等人，2008年；McCarthy等人，2017年；McCarthy和Chapron，2014年；Nyhus等人，2016年；Theile，2003年）。雪豹的隐秘性、难以捉摸的特性以及偏远的栖息地使得对其监测在资金、后勤和方法上都具有挑战性（Jackson等人，2006年；Watts等人，2019年）。由于这些挑战，使用相机陷阱或遗传学等可靠调查技术对全球雪豹分布范围进行系统采样的比例不到3%（Chetri等人，2019年；Jane?ka等人，2008年）。 在巴基斯坦，雪豹分布在三个不同的行政区域：吉尔吉特-巴尔蒂斯坦（GB）、阿扎德查谟和克什米尔（AJK）以及开伯尔-普赫图恩克瓦（KP），面积超过8万平方公里（Ahmad等人，2016年；Hussain，2003年；Schaller，1976年）。在全球范围内，雪豹被列为易危物种；然而在巴基斯坦，它被列为高度关注的保护物种（Sheikh和Molur，2004年）。雪豹是巴基斯坦研究最少的哺乳动物之一，关于其栖息地评估、分布和种群的现代调查文章很少（Din等人，2022年；Hameed等人，2020年；Nawaz等人，2021年）。然而，这些关于分布和种群的研究仅集中在雪豹适宜栖息地的较小范围内，无法反映整个物种的分布情况。先前的研究估计巴基斯坦有250至400只雪豹，但这些估计基于间接调查方法，如专家意见、问卷调查和适宜栖息地的评估，结果是从更小区域推断出来的（Hussain，2003年；Schaller，1976年）。最近，Nawaz等人（2025年）利用广泛的相机陷阱数据，通过空间显式捕捉-重捕（SECR，Efford，2004）方法估计巴基斯坦雪豹种群数量为155只（95%置信区间：100–239只）。然而，这一估计显著低于过去基于间接方法的主观估计（Hussain，2003年；Schaller，1976年）。为了确保这些基础种群估计的准确性和可靠性，独立验证至关重要，为当局制定保护计划提供坚实的基础。 在另一项平行研究中，Solari等人（2025a）开发了一种使用多重PCR SNP面板识别雪豹个体的新方法。该SNP面板包含144个SNP，最低等位基因调用准确率为96.7%，详细信息见Solari等人（2025a）。本研究旨在实现两个目标：1）部署新的多重PCR SNP面板，评估其在从大范围地理区域收集的粪便DNA中进行种群估计的有效性；2）运行SECR，从基因鉴定的个体中独立估计雪豹种群数量，并将其与相机捕获的估计结果进行比较，以建立巴基斯坦雪豹种群的可靠基准。

研究区域

本研究在巴基斯坦北部进行，覆盖了该国雪豹分布范围的约36%（Hameed等人，2020年；Din等人，2022年）。研究区域包括三个主要山脉：兴都库什山脉、喜马拉雅山脉和喀喇昆仑山脉，跨越KP省的Chitral地区、GB地区以及AJK的Neelum山谷（图1）。研究区域北接中国，西接阿富汗，东接印度（图1）。

非侵入性遗传样本

在1174份疑似雪豹样本中，约有36%未能成功扩增以确认物种。约235份样本被基因鉴定为雪豹，其余520份样本属于其他物种，如红狐（Vulpes vulpes）、喜马拉雅猞猁、喜马拉雅棕熊、狼/狗、亚洲胡狼（Canis aureus）、普通豹、豹猫（Prionailurus bengalensis）、尼泊尔灰叶猴（Semnopithecus schistaceus）和家畜。雪豹SNP面板仅用于确认为雪豹的样本。

讨论

在本研究中，我们使用了Solari等人（2025a）设计的新SNP面板，通过粪便样本识别雪豹个体，以估计巴基斯坦的雪豹种群数量。基于ΔAIC <2的模型显示，种群密度仅取决于性别和坡度或保护区状态。根据这些模型，巴基斯坦雪豹的种群数量平均估计为167.8只（95%置信区间127.18–220.6只），平均每100平方公里0.170只（0.130–0.225只）。

结论与建议

本研究证明了新的雪豹SNP面板（Solari等人，2025a）在可靠估计雪豹种群数量方面的有效性。通过改进粪便样本的收集和保存技术，可以提高基因分型的成功率（76%）。这可以通过培训调查人员识别和正确处理样本来实现，重点是在样本采集后2周内收集新鲜样本。 基于遗传学的种群估计结果与相机捕获的估计结果一致。 # RediT作者贡献声明 # Shakeel Ahmad: # 撰写 - 原稿、可视化、方法论、数据分析、概念化、调查 # Katherine A. Solari: # 撰写 - 审稿与编辑、软件使用、数据分析、概念化、方法论 # Ian Durbach: # 撰写 - 审稿与编辑、软件使用、数据分析、方法论、撰写 - 原稿 # Hussain Ali: # 方法论、调查、撰写 - 审稿与编辑 # Shoaib Hameed: # 方法论、数据管理、调查、撰写 - 审稿与编辑 # 竞争利益声明 # 作者声明没有已知的利益冲突。 # 致谢 # 我们感谢巴基斯坦的高等教育委员会（HEC）为我们在美国加州斯坦福大学完成这项工作提供财务支持。野外样本收集和遗传分析的财务支持来自英国的Darwin Initiative（资助编号：29-023）和Whitley Fund for Nature。同时，我们也感谢斯坦福大学生物系的Dmitri实验室提供了遗传样本分析的机会。