植物来源的细胞外囊泡作为一种双功能纳米平台，用于缺血性中风中的神经血管协同修复

《Biomaterials Advances》：Plant-derived extracellular vesicles as a dual-function nanoplatform for synergistic neurovascular repair in ischemic stroke

缺血性中风治疗需同时恢复代谢平衡、修复神经血管单元及递送亲脂性神经保护剂。本研究发现川芎（Ligusticum sinense）外泌体（CXEVs）可穿过血脑屏障，通过代谢重编程（调控30种关键代谢物）改善氨基酸代谢，缓解氨中毒和氧化应激，并激活VEGF信号通路促进血管再生。工程化负载G3702的CXEVs（G3702@CXEVs）展现出更优的稳定性、靶向性和协同疗效，显著优于单一治疗。该成果为开发植物源性多功能纳米药物平台提供了新策略。

　　

王聪|车可|郑琦|张光磊|史高成|孟慧慧|于浩|王俊松

南京科技大学环境与生物工程学院分子代谢中心，中国江苏省南京市小灵渭街200号，邮编210094

摘要

目前针对缺血性中风的疗法缺乏同时恢复代谢稳态、修复神经血管单元以及将疏水性神经保护剂输送穿过血脑屏障的能力。

本研究证明，从Ligusticum sinense（川芎）中提取的细胞外囊泡（CXEVs）——这些纳米级颗粒的尺寸为167.1±3.3纳米——天然富含邻苯二甲酸酯类化合物（约60%，包括川芎素和丁基邻苯二甲酸酯衍生物）。在全身给药后，CXEVs能够有效穿过血脑屏障，并在缺血性脑组织中积累，12小时时达到峰值浓度。在光血栓性中风的小鼠实验中，CXEVs剂量依赖性地改善了运动协调能力并减少了焦虑行为。非靶向代谢组学分析显示，CXEVs重新编程了7条代谢途径中的30种关键代谢物，尤其是恢复了精氨酸-脯氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和酪氨酸的代谢，从而减轻了氨毒性、氧化应激和能量衰竭。同时，CXEVs通过上调VEGFA和NOS3活性激活了VEGF信号通路，同时使KDR和MAPK1的表达恢复正常，促进了内皮细胞迁移、体外管状结构的形成以及斑马鱼的血管再生。为了增强治疗效果，我们设计了装载了G3702的CXEVs（G3702@CXEVs），其装载效率最高（1:2 w/w），在30天内具有出色的稳定性，并且能够持续释放药物而不会出现突然释放现象。关键的是，G3702@CXEVs在促进功能恢复、保护皮质结构以及协同增强神经发生（BrdU⁺/DCX⁺细胞）和血管生成（BrdU⁺/CD31⁺微血管）方面优于单独使用G3702或空白CXEVs。

CXEVs代表了一种新型的多功能纳米平台，它结合了植物化学物质介导的代谢重编程与天然的脑靶向能力。当装载G3702后，它们形成了一个协同的“治疗与递送”系统，能够同时修复中风后的神经元和血管损伤。这项工作证明了植物来源的EVs作为一种低成本、可扩展的双作用纳米医学平台，适用于复杂的神经系统疾病。

引言

缺血性中风仍然是一个严重的全球健康挑战[1]，是全球第二大死亡原因，也是长期残疾的主要原因之一。尽管经过数十年的研究，治疗选择仍然非常有限，组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是唯一获得FDA批准的药物治疗手段——但其治疗窗口仅为4.5小时[2]，并且有出血等重大禁忌症。现有的治疗方法无法解决脑缺血后的复杂病理生理过程，包括兴奋毒性、氧化应激、神经炎症、血脑屏障破坏以及最终的神经元死亡[3]。这一治疗空白促使人们积极探索替代方法，特别是那些具有多靶点作用机制且安全性良好的天然产物化合物[4]。然而，传统的药物递送系统在将治疗剂输送穿过血脑屏障（BBB）以到达缺血半影区方面面临巨大挑战，而及时干预对于挽救受损的神经组织至关重要[5],[6],[7]。

细胞外囊泡（EVs）作为一种有前景的天然纳米载体，具有天然的生物相容性、低免疫原性，并且能够有效穿越包括血脑屏障在内的生物屏障[8],[9],[10],[11]。虽然源自哺乳动物细胞的EVs在神经学应用方面已经得到了广泛研究[12],[13]，但源自植物的EVs在纳米医学领域仍是一个尚未充分探索但具有潜在变革性的前沿[14],[15],[16]。与哺乳动物来源的EVs相比，植物来源的EVs具有显著优势[17],[18]，包括可扩展的生产能力、较低的病原体传播风险以及较少的伦理问题。虽然从姜[19],[20]和葡萄柚[21],[22]等生物活性植物中分离出的EVs显示出良好的抗炎效果，但来自传统中药的EVs在神经系统疾病中的治疗应用仍然很大程度上未被开发，这为未来的研究提供了广阔的前景。关于植物来源EVs治疗缺血性中风的潜力，尤其是在其脑靶向能力、作用机制和治疗效果方面的认识仍然不足，这阻碍了创新性EV基中风疗法的发展。

Ligusticum sinense（川芎）是传统中药中的重要成分，数百年来一直被用于中风的治疗[23],[24]，其中含有多种生物活性化合物，尤其是川芎素和丁基邻苯二甲酸酯衍生物，这些化合物具有神经保护[25],[26]、抗炎[25],[27]和促血管生成[28],[29]作用。然而，由于生物利用度低、代谢速度快以及脑部渗透有限，川芎衍生化合物的临床应用受到限制。最新研究表明，川芎自然产生的EVs中含有高浓度的生物活性化合物，可能提供比单独使用化合物更有效的递送机制。这些源自川芎的细胞外囊泡（CXEVs）代表了一个有前景的治疗平台，可以同时递送多种协同作用的化合物，并利用EVs本身的靶向特性。尽管初步研究表明植物EVs能够携带特征性代谢物并表现出组织特异性趋向性[17]，但对CXEVs及其在缺血性中风模型中的作用机制的全面研究仍然不足。

尽管已有研究成功分离出了来自药用植物的细胞外囊泡[16],[20],[21]，但目前的研究主要集中在描述它们的内在治疗特性上。对于那些因生物利用度低、血脑屏障穿透性差或药代动力学特性不佳而难以治疗的患者，植物来源的EVs作为天然纳米载体的潜力仍未得到充分探索。这些植物来源的纳米囊泡具有多种优势，包括天然的生物相容性、低免疫原性和内在的靶向能力，使其成为解决神经治疗递送挑战的有希望的候选者。

以G3702为代表的丁基邻苯二甲酸酯衍生物在中风治疗中显示出巨大潜力[30],[31]，但其临床应用受到药代动力学限制的严重阻碍。将CXEVs作为G3702的天然纳米载体进行开发，是一种创新策略，可以同时提高药物递送效率并利用囊泡本身的治疗特性。这种双重效益的策略代表了从传统药物递送系统向协同治疗平台的转变。

尽管具有这种潜力，但在这些综合方法的可行性、稳定性和协同效应方面仍存在关键的知识空白。本研究通过全面表征CXEVs、严格评估其脑靶向能力、详细阐明其代谢调控机制以及开发新型的G3702装载CXEVs（G3702@CXEVs）配方，系统地解决了这些限制。

基于这些前提，我们假设CXEVs可以作为一个多功能纳米平台，结合植物化学物质的神经保护和天然的脑靶向递送功能。此外，我们推测将疏水性神经保护剂G3702装载到CXEVs中可以创建一个协同的“治疗与递送”系统，优于单一疗法。本研究旨在系统地表征CXEVs，阐明其代谢重编程机制，并验证装载G3702的CXEVs（G3702@CXEVs）在缺血性中风中的协同神经血管修复效果。

动物和细胞系来源及伦理批准

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由中国科学院上海细胞库提供。转基因斑马鱼Tg(kdrl:EGFP)由南京EzeRinka生物技术有限公司提供，在28.5°C、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养。雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄，20-25克）由江苏青龙山生物技术有限公司提供，饲养在控制环境中（22±2°C，50±10%湿度）

CXEVs的物理化学特性和脑靶向特性

为了阐明CXEVs的物理化学特性和脑靶向潜力，我们采用连续超速离心法进行分离（图1A），并进行了全面的表征分析。透射电子显微镜观察显示CXEVs具有典型的球形或杯状形态（图1B）。动态光散射分析表明其平均粒径为167.1±3.3纳米（图1C），多分散指数（PDI）为

讨论

本研究确立了CXEVs作为缺血性中风的新治疗平台，证明了它们独特的脑靶向能力、剂量依赖性的神经血管保护作用以及在装载神经保护剂G3702后的协同增强效果。我们的发现表明，CXEVs在缺血性脑组织中协调了全面的代谢重编程，同时激活了VEGF信号通路，形成了促进神经血管修复的双重作用机制

结论

总之，本研究通过将CXEVs确立为一个一流的多功能平台，证明了其在缺血性中风中的治疗潜力，该平台能够同时针对代谢崩溃、血管衰竭和神经元损伤——不是通过单独的干预措施，而是通过内源性的、系统级的重编程实现的

参与同意书及发表同意书

所有参与者均提供了知情同意。

作者贡献声明

王聪：撰写——初稿、方法学、资金获取、概念构思。车可：撰写——初稿、方法学。郑琦：方法学、数据管理。张光磊：软件开发。史高成：验证、资源准备。孟慧慧：验证。于浩：撰写——审稿与编辑、监督。王俊松：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、资金获取、概念构思。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本论文的过程中，作者使用了ChatGPT和Claude等AI工具来辅助语言润色，提高手稿的清晰度和流畅性。使用这些工具后，作者仔细审查、修改和编辑了内容，并对发表文章的准确性、完整性和最终内容负全责。

资金支持

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：81773857）和江苏省研究生研究与实践创新计划（项目编号：KYCX24_0689）的支持。

利益冲突声明

作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。