《Food and Bioprocess Technology》：Influence of Formulation pH and Ionic Strength on the Techno-Functional Behaviour of Legume Grass Protein Concentrates Obtained by Gentle Membrane Separation
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本研究针对新型植物蛋白配料在复杂食品体系中功能行为预测的难题，以温和膜分离技术结合喷雾干燥制备的富含RuBisCO的豆科牧草蛋白浓缩物为对象，系统考察了其在模拟商业配方条件下（两个pH水平：4和7；两个离子强度：0.02 M和0.2 M NaCl）的理化及功能特性（溶解性、凝胶性、起泡性）。研究发现，喷雾干燥过程的规模（实验室与中试）及出口温度（70°C vs. 85°C）对原料基本特性（如疏水性、粒径）有影响，但未显著改变其功能表现；pH是主导功能特性的关键因素，酸性条件（pH 4）下泡沫稳定性更佳，而中性条件（pH 7）下凝胶强度与成胶能力更高；离子强度对溶解性和凝胶硬度有轻微正向影响。该研究揭示了LGCs作为可持续蛋白配料在广泛植物基食品应用中的多功能性，为绿色生物质蛋白的高值化利用提供了重要理论依据。
随着气候变化议题日益受到关注，以及消费者向植物基饮食转变的趋势不断增强，市场对能够减少对传统作物依赖、同时保持高功能性和营养价值的替代性可持续蛋白质源的需求持续增长。绿色生物质，特别是豆科与禾本科牧草混合物（如三叶草和黑麦草），因其资源丰富且蛋白质组成优良而成为一种极具潜力的候选原料。这类材料中的主要蛋白质是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶，它是光合作用的关键酶，也是自然界中最丰富的蛋白质。尽管RuBisCO具有平衡的必需氨基酸组成和良好的功能特性（如溶解性、起泡性、凝胶性和乳化性），其作为食品配料的全面整合仍面临挑战，关键在于需要深入了解其在食品相关条件下的功能行为，以及常见工业加工过程对其产生的影响。以往的生产方法往往侧重于生产“饲料级”蛋白质，涉及热凝固或酸沉淀等工艺，这些工艺会影响得率和蛋白质功能，且产品常带有绿色和苦味，不适用于人类食品。因此，开发适合人类消费的、能有效去除颜色和苦味的蛋白浓缩物生产工艺至关重要。
本研究旨在解决上述知识空白，重点研究通过温和、工业可扩展的膜过滤系统结合喷雾干燥获得的豆科牧草蛋白浓缩物的理化性质和功能特性。研究评估了pH和离子强度对LGCs功能特性的影响，以模拟配方食品中遇到的条件。同时，基于先前研究结果，即冷冻干燥或出口温度≤85°C的喷雾干燥不会显著影响RuBisCO富含配料的功能性，本研究进一步探讨了喷雾干燥过程的空气出口温度（70°C或85°C）和干燥设备规模（实验室规模与中试规模）是否影响这些性质。
研究人员利用在丹麦日德兰半岛三个不同田块种植的商业豆科牧草混合物（均包含红三叶草和/或白三叶草以及黑麦草）作为原料。LGC的生产过程包括螺旋压榨，随后对绿汁进行过滤（采用定制构建的过滤单元，包括微滤和超滤等步骤），整个过程没有施加热处理，温度保持在35°C以下。最终获得的液体LGC通过两种不同规模和工艺条件的喷雾干燥进行干燥：LGT1使用中试规模的Niro Atomiser Mobile Minor喷雾干燥器（入口温度220–240°C，出口温度68–70°C）；LGT2使用实验室规模的Yamato Ohkawara DL41喷雾干燥器（入口温度246°C，出口温度83–85°C）。
为了评估LGC配料在真实食品产品条件下的行为，研究人员设计了四种食品体系，反映了常见食品产品的相关pH水平和离子强度（I）。选择了两种pH条件：中性（pH 7）和酸性（pH 4）。这两种条件分别与两种I水平相结合：低（0.02 M）和高（0.2 M），基于食品中典型的盐（NaCl）浓度。
对两种LGC配料的基本特性分析表明，它们的蛋白质含量均约为66 g/100 g，无显著差异。LGT2的粉末颜色更浅（L*值更高）。粒径分布显示两者均呈单峰分布，但LGT2的粒径略大，表明在LGT2的喷雾干燥过程中发生了更显著的蛋白质聚集。傅里叶变换红外光谱分析表明，干燥温度并未改变蛋白质的一级和二级结构。在天然pH下，两种LGC均表现出负的ζ-电位，LGT1的负值显著较小，这可能是由于不同的再聚集过程改变了表面暴露和静电特性。表面疏水性分析显示，喷雾干燥温度升高导致表面疏水性降低，这可能是由于变性后暴露的反应性基团驱动聚集，导致新的疏水堆积。
在天然条件下的功能评估显示，LGCs的蛋白质溶解度在pH 3-8范围内呈现典型的U型曲线，在pH 4（接近RuBisCO的等电点）时溶解度最低，在pH 7时溶解度最高（>90%）。两种LGCs的最低成胶浓度均为2%（w/w），显示出高成胶潜力。两者的起泡能力和泡沫稳定性在天然条件下相似，泡沫体积约为注入气体体积的1.2倍，15分钟后能保持约65%的初始泡沫体积。喷雾干燥温度的不同并未导致溶解度、起泡性或凝胶性能的显著差异。
在模拟食品体系中，pH对LGCs的特性及功能表现产生了显著影响。在酸性条件（S3和S4，pH 4）下，蛋白质的ζ-电位接近零，导致分子间排斥力减小，蛋白质-蛋白质相互作用增强，从而促进聚集和沉淀，溶解度显著降低。与此相反，在中性pH条件（S1和S2，pH 7）下，蛋白质具有高的净表面电荷，有利于分子排斥和蛋白质-溶剂相互作用，因此溶解度很高（>90%）。离子强度的影响主要体现在中性pH条件下，高离子强度（S1, 0.2 M NaCl）通过电荷屏蔽效应，略微提高了蛋白质溶解度。
凝胶特性方面，在酸性条件下（S3和S4），形成自支撑凝胶所需的蛋白质浓度升高至5%，且形成的凝胶强度显著低于中性pH条件下的凝胶。而在中性pH、高离子强度（S1）下形成的凝胶强度最高。这归因于盐离子屏蔽了蛋白质电荷，减少了静电排斥，从而促进了强烈的蛋白质-蛋白质相互作用（主要是疏水相互作用）。通过添加特定阻断剂研究蛋白质-蛋白质相互作用发现，硫脲（抑制疏水相互作用）完全阻止了凝胶形成，尿素（抑制氢键）降低了凝胶硬度，而二硫苏糖醇（还原二硫键）则没有影响，氯化钠则增强了凝胶硬度。这表明疏水相互作用是LGCs凝胶形成的主要驱动力，氢键也起到一定作用，而二硫键则不参与。
起泡特性方面，两种LGCs在不同食品体系中的起泡能力相似，中性环境（S1和S2）下的起泡能力略优于酸性条件（S3和S4）。然而，酸性条件下形成的泡沫表现出卓越的稳定性，15分钟内泡沫高度几乎未下降。这可能是由于在pH接近等电点时，蛋白质颗粒更小，能更快扩散到空气-水界面并形成致密、牢固的薄膜。离子强度对起泡能力和泡沫稳定性均无显著影响。对蛋白质-蛋白质相互作用的研究表明，没有单一的相互作用主导泡沫稳定性，各种相互作用（疏水作用、氢键、静电作用）共同贡献于泡沫的稳定。
本研究系统地表征了通过温和膜过滤工艺生产的豆科牧草蛋白浓缩物在不同配方条件下的功能行为。结果表明，喷雾干燥过程（规模及出口温度）引起的基本特性变化（如疏水性、粒径）并未显著影响其功能表现。pH是决定LGCs功能特性的最关键因素，酸性条件有利于泡沫稳定性，而中性条件有利于凝胶特性。离子强度的影响相对较小，但对溶解性和凝胶硬度有积极影响。蛋白质-蛋白质相互作用分析明确显示，凝胶化主要由疏水相互作用驱动，其次是氢键。而起泡现象似乎不受单一相互作用的支配，而是多种相互作用协同的结果。
该研究证实了LGCs作为一种由绿色生物质衍生的蛋白质配料，在广泛的食品应用中具有巨大的潜力。其功能特性对加工条件和配方条件的响应规律，为食品工业中有效利用这类可持续蛋白质资源提供了重要的科学依据和实践指导，支持了蛋白质来源的多样化，并加速向更环保的食品生产过渡的进程。未来的研究可以集中于更复杂的食品体系，以进一步了解LGCs与典型食品组分（如脂质和碳水化合物）的相互作用，以及其他常见加工实践的影响。
