《Bioresource Technology》：High-reactivity biological sulfur granulation: Cross-kingdom consortium for efficient mixotrophic denitrification
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本研究通过Cofactor-Pathway-Process（CPP）工程策略系统解决2-羟基苯嗪生产中的羟基化效率低、前体不足及发酵周期长三大瓶颈，在摇瓶和5L生物反应器中实现产量2291.56 mg/L和2663.12 mg/L，较现有报道提高2.18倍，总发酵时间缩短36小时。
聂艳芳|黄鹏|李旭轩|胡定康|董凯新|张学宏|岳生杰|胡洪波
中国上海交通大学微生物代谢国家重点实验室与生命科学与生物技术学院
摘要
小麦全蚀病对全球粮食安全构成了严重威胁，因此迫切需要有效的生物控制剂。2-羟基吩嗪（2-OH-PHZ）对引起小麦全蚀病的病原体具有比商业杀虫剂吩嗪-1-羧酸（PCA）更强的抗真菌活性。然而，2-OH-PHZ的生物合成受到三个关键限制的制约：黄素依赖性单加氧酶PhzO的羟基化效率低、前体PCA的细胞内供应不足以及发酵过程较长。为系统解决这些相互关联的问题，我们在Pseudomonas chlororaphis LX24中开发并实施了一种辅因子-途径-过程（CPP）工程策略。首先，通过改善FADH2和NADPH的供应来增强PhzO的活性，将羟基化效率从22%提高到85%以上。随后，通过优化吩嗪生物合成途径来克服前体限制，使2-OH-PHZ的积累量增加了2.18倍，达到988.25?mg/L。结合培养基优化和phzO的过表达，在摇瓶中2-OH-PHZ的浓度达到了2291.56?mg/L，在5升生物反应器中达到了2663.12?mg/L，这是迄今为止报道的最高产量。最后，引入了两阶段温度转换发酵工艺，加速了中间体2-羟基吩嗪-1-羧酸的脱羧反应，将总发酵时间缩短了36小时，并显著提高了工艺效率和可持续性。总之，这种综合CPP策略成功克服了2-OH-PHZ生物合成中的多个瓶颈，实现了创纪录的高产量，证明了其作为吩嗪衍生物和其他高价值天然产物可持续生物生产通用蓝图的价值。
引言
吩嗪是一类含有氮的杂环化合物，具有广谱抗菌活性，使其成为可持续农用化学品的有希望的候选者（Guttenberger等人，2017年；Huang等人，2024年）。自20世纪初以来，人们探索了多种吩嗪的化学合成方法，例如在碱性条件下高温下将苯胺和硝基苯融合，以及使用Pd催化的偶联反应（Laha等人，2013年；Wohl和Aue，1901年）。然而，这些方法通常涉及昂贵的催化剂、苛刻的反应条件以及有毒副产物的产生（Krishnaiah等人，2018年；Tietze等人，2005年）。相比之下，微生物生物合成提供了一种绿色且可持续的替代方案，它在温和条件下运行，使用可再生碳源，并将有害废物降到最低。这种方法已经通过成功开发吩嗪-1-羧酸（PCA）证明了其商业可行性，PCA在中国已被注册为生物杀虫剂“Shenqinmycin”（Jin等人，2015年）。
在超过180种天然存在的吩嗪中，2-羟基吩嗪（2-OH-PHZ）因其对多种关键植物病原体的更强抗真菌活性而显得特别有前景。据报道，2-OH-PHZ对引起小麦根病的全蚀病的Gaeumannomyces graminis var. tritici的抑制作用更强，这是目前小麦根部最严重的疾病（Delaney等人，2001年；Yu等人，2018年）。值得注意的是，2-OH-PHZ对Rhizoctonia solani AG-1的抑制作用非常强，其最小抑制浓度（MIC）仅为2.0?μg/mL（Park等人，2012年），同时对Alternaria alternata 2（Zameer等人，2025年）和其他病原体（包括Phytophthora infestans和Streptomyces scabies，Biessy等人，2021年）也表现出增强的活性。这些发现突显了2-OH-PHZ作为下一代抗真菌剂的巨大潜力。
尽管前景广阔，但由于生产限制，2-OH-PHZ的广泛应用受到了严重阻碍。已知只有少数微生物能够产生2-OH-PHZ，主要包括Pseudomonas chlororaphis和Methanosarcina thermophila（Abken等人，1998年；Levitch和Rietz，1966年），其中前者被认为是一种促进植物生长的根际细菌（PGPR）。报道的2-OH-PHZ的天然产量通常较低，在P. chlororaphis中约为2.6至158.6?mg/L（Liu等人，2016年；Liu等人，2021年；Thorwall等人，2023年）。为了解决这个问题，人们采用了调节吩嗪合成和优化发酵等策略。例如，通过删除负调控基因并结合发酵优化，P. chlororaphis LX24中的2-OH-PHZ产量从158.6?mg/L提高到了677.1?mg/L，这是迄今为止报道的最高产量（Liu等人，2021年）。然而，其浓度仍远低于商业杀虫剂PCA的10,653?mg/L（Liu等人，2023年），这突显了工业应用的持续挑战。
这一生产挑战背后有三个相互关联的瓶颈。第一个主要瓶颈是黄素依赖性单加氧酶PhzO的羟基化效率低，它将PCA转化为2-羟基吩嗪-1-羧酸（2-OH-PCA）和2-OH-PHZ的转化率仅为10%–20%（Chen等人，2014年；Delaney等人，2001年）。这一酶学限制还因辅因子依赖性而加剧，因为PhzO需要足够的FADH2和NAD(P)H才能发挥最佳功能（Chenprakhon等人，2019年；Delaney等人，2001年）。其次，前体供应不足经常限制生物合成途径的通量，因为即使提高了PhzO的活性，如果PCA积累不足，也无法支持高效转化为2-OH-PHZ（Nie等人，2025年）。第三，超过96小时的延长发酵周期导致产量仅为4.69–7.05?mg/L/h（Liu等人，2016年；Liu等人，2021年），使得该过程在大规模生产中经济上不可行。以往通过辅因子工程（Nie等人，2025年）、途径优化（Li等人，2020年）或工艺改进（Xue等人，2025年）来解决单个瓶颈的方法仅取得了有限的成功，这表明需要一种同时针对所有主要瓶颈的综合性策略。
在这里，我们在P. chlororaphis LX24中提出了一种全面的辅因子-途径-过程（CPP）工程策略，通过以下方式同时解决了所有主要瓶颈：（i）增强FADH2/NADPH的供应；（ii）优化代谢途径；（iii）创新的兩阶段温度转换发酵。这种综合方法为2-OH-PHZ的生物合成建立了一条绿色且可扩展的路线，并为微生物生产高价值天然产物提供了一个通用范例。
部分摘要
微生物、发酵条件和细胞生长检测
本研究中的所有菌株和质粒均列在补充材料中。Escherichia coli DH5α和S17-1在Luria–Bertani（LB）培养基（10?g/L色氨酸，5?g/L酵母提取物，10?g/L NaCl）中培养。P. chlororaphis LX24在King’s B（KB）培养基（20?g/L色氨酸，18.92?g/L甘油，0.514?g/L K2HPO4，0.732?g/L MgSO4
通过提高羟基化效率来增强2-OH-PHZ的产量
辅因子工程在生物催化过程中起着关键作用。充足的辅因子供应不仅提高了羟基化效率（Nie等人，2025年；Zhou等人，2022年），还引导代谢流向目标合成（Li等人，2019年）。PhzO属于双组分黄素依赖性（TC-FDM）家族（Delaney等人，2001年）。TC-FDMs依赖FADH2（由外源提供或由专用的黄素还原酶生成）来催化羟基化反应（Delaney等人，
结论
吩嗪衍生物因其广泛的生物活性而引起了广泛关注（Miksa，2022年），但高效合成2-OH-PHZ仍然具有挑战性。在这里，我们在P. chlororaphis LX24中建立了一种辅因子-途径-过程（CPP）工程策略，以克服2-OH-PHZ生产中的关键瓶颈，包括PhzO的羟基化效率低、前体限制和发酵时间过长等问题。这种综合方法在摇瓶中实现了创纪录的2-OH-PHZ浓度2291.56?mg/L
CRediT作者贡献声明
聂艳芳：方法学研究、数据分析、概念构建。黄鹏：方法学研究、数据分析、概念构建。李旭轩：数据分析、概念构建。胡定康：数据分析。董凯新：方法学研究、数据分析。张学宏：方法学研究、数据分析。岳生杰：研究工作、资金获取、数据分析。胡洪波：项目管理、研究工作、资金协调
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号22308214和22378262）的财政支持。
